Alternatieven voor methyleenblauw voor microscopie: kies op basis van de taak

Voor een eenvoudig bacterieel uitstrijkje kan kristalviolet methyleenblauw vervangen wanneer het doel is om de celvorm te bekijken. Voor levende cellen kan fasecontrast zonder enige kleuring een beter alternatief zijn. De keuze hangt af van de waarneming die je moet doen.

Stel dat twee mensen dezelfde bacteriecultuur onderzoeken. De een wil staafvormige cellen onderscheiden van ronde cellen. De ander wil weten of een behandeling de bacteriën heeft gedood. Een kleuring die de eerste persoon een duidelijk beeld geeft, kan de tweede persoon geen bruikbaar antwoord opleveren.

Vul voordat je een vervanging kiest deze zin aan: “Ik moet ___ in ___ waarnemen, en de cellen moeten / hoeven niet in leven te blijven.” Die zin bepaalt welke taak de kleuring moet uitvoeren.

Begin met het preparaat en de vraag

Bepaal eerst of de cellen in leven moeten blijven en identificeer vervolgens het kenmerk dat je moet waarnemen:

• Cellen moeten in leven blijven: overweeg voor beweging of vorm fasecontrast of DIC zonder kleuring; overweeg voor nucleair DNA Hoechst 33342 met fluorescentie; kies voor membraanintegriteit een gevalideerde assay zoals SYTO 9 met propidiumjodide.
• Cellen hoeven niet in leven te blijven: overweeg voor bacteriële morfologie een eenvoudige kristalvioletkleuring of negatieve kleuring met nigrosine; gebruik voor de Gram-reactie de volledige Gram-kleuringsmethode; overweeg voor nucleair DNA in gefixeerde cellen DAPI-fluorescentie. Gebruik deze tabel om de beperkingen van elke optie te vergelijken. Dit zijn keuzes tussen methoden, geen instructies om binnen een bestaand protocol reagentia onderling te vervangen.

Vervang bij een eenvoudig uitstrijkje de methode zorgvuldig

Kristalviolet is een praktische kandidaat wanneer de taak bestaat uit een eenkleurige weergave van bacteriële morfologie. Het Bacteriological Analytical Manual van de FDA vermeldt twee kristalvioletformuleringen die geschikt zijn voor eenvoudige kleuring. Gebruik een gedocumenteerde formulering en de bijbehorende bereidingsmethode; alleen de naam van de kleurstof specificeert geen gebruiksklaar reagens.

Kristalviolet wordt ook gebruikt bij Gram-kleuring, maar dat maakt een eenvoudige kristalvioletkleuring nog geen Gram-kleuring. In het Gram-kleuringsprotocol van ASM hangt het differentiële resultaat af van kristalviolet, jodium, ontkleuring en tegenkleuring die achtereenvolgens worden toegepast. Het weglaten van die stappen verandert wat op basis van het beeld kan worden vastgesteld. Zie eenvoudige kleuring versus Gram-kleuring voor dat onderscheid.

Nigrosine biedt een andere manier om contouren zichtbaar te maken: het maakt de achtergrond donker terwijl de bacteriële cellen relatief licht blijven. De instructies van Merck voor nigrosine bevatten een nuttig detail dat in een algemene lijst met vervangingsmiddelen gemakkelijk ontbreekt. De gespecificeerde gebruiksformulering bevat formaldehyde. Je kunt daarom uit de woorden “negatieve kleuring” niet afleiden dat de methode geschikt is voor levende cellen, ook al lijken de cellen zelf ongekleurd. Controleer de volledige formulering en de preparatie van het monster.

Overweeg bij levende preparaten de optiek te veranderen

Als je cellen wilt zien bewegen of delen, kan het toevoegen van een andere kleurstof de waarneming compliceren. Zoals Nikon uitlegt in zijn gids over contrast in transparante preparaten, maken fasecontrast en differentieel-interferentiecontrast, of DIC, preparaten zichtbaar door verschillen in hun optische eigenschappen. Daarmee kunnen levende, ongekleurde cellen zichtbaar worden gemaakt, mits de microscoop over de vereiste componenten beschikt.

Met deze keuze blijft het preparaat ongekleurd, maar verandert de beschikbare informatie. Je kunt een begrenzing of beweging volgen zonder te weten welk molecuul het contrast heeft veroorzaakt. Als de vraag om moleculaire lokalisatie draait, kies dan in plaats daarvan een geschikte labelingsmethode.

Voor nucleair DNA maakt Invitrogen in zijn vergelijking van DAPI- en Hoechst-kleuringen onderscheid tussen het gebruikelijke gebruik van DAPI bij gefixeerde cellen en het beter celpermeabele Hoechst 33342, dat de voorkeur krijgt voor labeling van levende cellen. Beide vereisen fluorescentieapparatuur. Geen van beide is een directe vervanging voor een gekleurde helderveldkleuring.

Behandel blootstelling aan kleurstof en verlichting als experimentele omstandigheden. Vergelijk gekleurde en ongekleurde preparaten wanneer het gedrag van de cellen de te meten grootheid is.

Een rode cel is niet automatisch een dode cel

SYTO 9 en propidiumjodide worden vaak samen gebruikt om de integriteit van bacteriële membranen te beoordelen. De BacLight-handleiding koppelt intacte membranen aan groene kleuring en beschadigde membranen aan rode kleuring. Die interpretatie moet voor het betreffende preparaat worden gevalideerd.

Een onderzoek uit 2019 van Rosenberg en collega's illustreert het probleem. In 24 uur oude E. coli-biofilms op glas in fosfaatgebufferde zoutoplossing leek ongeveer 96% van de cellen in situ positief voor propidiumjodide. Toch schatten de auteurs dat 82% na het oogsten kweekbaar was. Confocale beelden toonden cellen met groene binnenstructuren onder rood gekleurd materiaal, wat erop wees dat extracellulaire nucleïnezuren bijdroegen aan het misleidende signaal.

Die percentages beschrijven verschillende metingen aan de preparaten uit het onderzoek en zijn geen universele correctiefactor. De nuttige les is dat je moet controleren waardoor het signaal is ontstaan. In een biofilm kan een nucleïnezuurkleurstof materiaal buiten de cellen detecteren, naast materiaal in beschadigde cellen. Voor een conclusie over levensvatbaarheid bevelen de onderzoekers aanvullende metingen aan, zoals kweek of metabole activiteit, waarbij ze erkennen dat elke methode beperkingen heeft.

Controleer wat het alternatief daadwerkelijk bevat

Een alternatieve kleuringsmethode kan nog steeds methyleenblauw bevatten. Giemsa is daar een voorbeeld van: Merck beschrijft zijn product als een azure-eosin-methylene-blue-oplossing, bedoeld voor toepassingen waaronder bloed- en beenmerguitstrijkjes. Het kan een andere methode zijn voor een ander preparaat, maar het voldoet niet aan een vereiste om methyleenblauw uit te sluiten.

Als het uitsluiten van een verbinding deel uitmaakt van het experiment, controleer dan de identiteit en formulering van het reagens voordat je beelden vergelijkt. De gids over methyl blue, methylene blue en kleurstoffen met vergelijkbare namen behandelt de verschillen in naamgeving.

Verifieer de vervanging voordat je het resultaat gebruikt

Maak voor een nieuwe methode een kleine vergelijking met representatieve preparaten en een geschikte controle. Houd de microscoopinstellingen waar mogelijk vergelijkbaar. Leg de reagensformulering, preparatie van het monster, blootstelling en beeldvormingsomstandigheden vast, zodat kan worden onderzocht waarom een beeld er beter uitziet in plaats van het alleen op die basis te verkiezen.

Beoordeel het succes aan de hand van de oorspronkelijke vraag. Beoordeel voor morfologie of celgrenzen en rangschikking interpreteerbaar blijven. Beoordeel bij nucleaire labeling de locatie van het signaal en de achtergrond. Vereis voor levensvatbaarheid bewijs dat verder gaat dan een aantrekkelijke kleurscheiding. De uitgebreidere gids over kleuring met methyleenblauw en laboratoriumtoepassingen legt uit hoe de waarneming en de preparatie op elkaar aansluiten.

Kies het alternatief dat de meting behoudt die je nodig hebt. Kleur is slechts één eigenschap van het resulterende beeld.