Metylenblått og leukometylenblått: ett redokspar, to farger

En student tilsetter noen dråper blått fargestoff i en kolbe, svinger den rundt og ser fargen forsvinne. Hun rister kolben, og blåfargen kommer tilbake. Ingenting ble tilsatt eller fjernet mellom de to tilstandene, bortsett fra elektroner og kontakt med luft. Den kolben rommer hele temaet for denne artikkelen: metylenblått og dets reduserte partner, leukometylenblått, som omdannes til hverandre i et reversibelt redokspar der fargen er avlesningen.

Det praktiske poenget kommer først. Fargeendringen er ikke en bivirkning her. Den er det analytiske signalet. Alle som lager formuleringer med metylenblått, titrerer med det eller bruker det i undervisning, bør kunne skrive halvreaksjonen fra hukommelsen, angi betingelsene som skyver den mot venstre eller høyre, og navngi urenhetene som gjør resultatet uklart.

Paret i én ligning

Oksidert metylenblått er metyltioniniumkationet: et plant fenotiaziniumsystem med svovel og nitrogen i den sentrale ringen og en dimetylaminogruppe i hver ende, levert som kloridsaltet. PubChem registrerer det som metyltioniniumklorid, C.I. Basic Blue 9. I vann absorberer monomeren nær 664 nm, noe som gir blåfargen øyet ser.

Redusert leukometylenblått (LMB) har samme molekylskjelett, men nitrogenet i den sentrale ringen er protonert og kromoforen brutt. Det er uladet ved tilnærmet nøytral pH og nesten fargeløst, med ubetydelig absorbans i det synlige området og et sterkt ultrafiolett bånd nær 258 nm (PubChem-oppføring for leukometylenblått, CAS 613-11-6). Antallet protoner i halvreaksjonen avhenger av pH, fordi den reduserte formen protoneres i surt miljø (omtrentlige pKa-verdier nær 4.5 og 5.8). Tre områder dekker det praktiske spennet:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, blått <=> fargeløst (ved tilnærmet nøytral pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), blått <=> fargeløst (moderat surt, 2 protoner)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> dobbelt protonert leukoform (sterkt surt, 3 protoner)

Alle tre skrivemåtene beskriver det samme paret ved ulike protoneringstilstander, et poeng litteraturen om redoksatferden til tiazin-fargestoffer behandler systematisk. pH-avhengigheten følger Nernst-ligningen for Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, som gir en stigning på omtrent 29.6, 59.2 eller 88.7 mV per pH-enhet for m = 1, 2 eller 3. Målte stigninger nær 28, 58 og 87 mV per pH-enhet bekrefter tilordningen, så et oppgitt potensial uten tilhørende pH er meningsløst.

Hva ligningen forteller en formulerer

Tre forhold følger av støkiometrien. For det første betyr to elektroner per molekyl at metylenblått i nettoreaksjonen er en toelektronindikator og -mediator, ikke en ett-elektrontransportør. For det andre deltar protoner, så det formelle potensialet endres med pH som beskrevet ovenfor. For det tredje ligger det formelle potensialet ved pH 7 nær +0.011 V mot standard hydrogenelektrode (omtrent +0.53 V ved pH 0), noe som plasserer paret blant milde oksidasjonsmidler: sterkt nok til å ta imot elektroner fra gode donorer som NAD(P)H eller askorbat, og svakt nok til å gi dem videre til oppløst oksygen eller jern(III)-sentre. Denne mellomposisjonen er nettopp grunnen til at fargestoffet gjennomgår sykluser i stedet for å bli sittende fast i én ende.

Konsentrasjonen tilfører enda en komplikasjon. Over omtrent hundre mikromolar i vann, i samsvar med en rapportert dissosiasjonskonstant for monomer–dimer-likevekten nær 170 til 250 uM ved pH 7, stabler det oksiderte kationet seg i dimerer og større aggregater med et forskjøvet absorpsjonsbånd nær 610 til 615 nm. Et spektrum der toppen ser forskjøvet ut, kan derfor bety aggregering, ikke urenheter. Fortynn først, og vurder deretter.

Betingelser som driver hver retning

Tabellen nedenfor er en referanse for laboratoriearbeid. Reduksjon krever en elektrondonor; reoksidasjon krever en elektronakseptor, og luft er vanligvis tilstrekkelig.

Hver rad følger den samme ligningen. Bare drivkraften endres. Det er i denne betydningen paret er reversibelt: veien er den samme, men den følges i motsatte retninger under motsatte betingelser.

Den blå flasken forklart

Mekanismen i demonstrasjonen fortjener en tydelig forklaring, fordi den viser paret i miniatyr. I alkalisk glukoseløsning fremmer basen enolisering av glukose, og enediolatet som dannes, reduserer metylenblått til leukometylenblått, slik at kolben blir fargeløs. Risting løser opp oksygen fra gassrommet over væsken, oksygenet reoksiderer leukoformen, og blåfargen kommer tilbake. Når kolben står i ro, brukes oppløst oksygen opp nær reaksjonssonen ved overflaten, og glukosen vinner igjen. Syklusen gjentas til glukosen er brukt opp, og hver risting er en synlig Nernst-ligning: øk oksidasjonsmidlets aktivitet, og likevekten forskyves mot blått.

Radikalet i midten

Nettoreaksjonen overfører to elektroner, men elementærtrinnene overfører ett om gangen. Mellom det blå kationet og den fargeløse leukoformen finnes et semikinonradikal som mellomprodukt. Det disproporsjonerer hovedsakelig tilbake til paret i stedet for å hope seg opp. Ett-elektronpotensialet nær minus 0.23 V ved pH 7 ligger langt under midtpunktspotensialet for nettooverføringen av to elektroner, og derfor forblir radikalet en mindre bestanddel i den stasjonære tilstanden. Det har betydning av to grunner. Under belysning når fargestoffet eksiterte tilstander som åpner for radikalreaksjoner. Derfor er metylenblåttløsninger lysfølsomme, og derfor hører fotokjemi hjemme i enhver stabilitetsprotokoll. Ved høy konsentrasjon dimeriserer dessuten den oksiderte formen, noe som endrer spekteret og den tilsynelatende kinetikken uten å endre det underliggende paret. Ingen av disse forholdene opphever reversibiliteten. Begge forklarer observasjoner som ellers kan se ut som irreversibilitet.

Demetylerte beslektede forbindelser forskyver skalaen

Fjern metylgrupper fra de to dimetylaminogruppene, og paret består, men med endrede egenskaper. Absorpsjonsmaksimumet forskyves monotont mot kortere bølgelengder ved hver demetylering: metylenblått nær 664 nm, Azure B nær 654, Azure A nær 630, Azure C nær 615 og tionin nær 600 nm. Azure B, som mangler én metylgruppe, er den nærmeste slektningen: en viktig metabolitt av metylenblått og en dokumentert urenhet i metylenblåttmateriale. Azure A og Azure C viderefører serien med det samme redoksaktive molekylskjelettet. Tionin, der begge aminogruppene er fullstendig demetylert, står sist med et formelt potensial nær +0.06 V ved pH 7, mot +0.011 V for metylenblått, og er merkbart lettere å redusere. Redokspotensialene i serien avhenger av medium og elektrode, så sammenlign bare verdier under samme betingelser. Derfor er kartlegging av urenheter et redoksspørsmål, ikke bare en avkryssing for renhet. Noen få prosent Azure B betyr noen få prosent av et annet redokspar i flasken, og Azure B som urenhet og metabolitt dokumenterer hvordan denne andelen kontrolleres.

Hvor biologien kommer inn

Inne i en rød blodcelle reduserer NADPH metylenblått til leukometylenblått, og leukoformen overfører elektroner til jern(III) i hem, slik at hemoglobinets jern(II)-tilstand gjenopprettes. Denne ene elektronoverføringskjeden er det kjemiske grunnlaget for bruk av metylenblått ved ervervet methemoglobinemi. Alt som følger etter denne kjeden, energimetabolisme, mitokondriell elektronstrøm og eventuelle biologiske utfall, hører til mitokondriell elektrontransport og er bevisst overlatt til den artikkelen.

Kjøp paret, ikke bare fargen

Et redoksfargestoff er bare så godt som spesifikasjonen. Høy renhet er viktig fordi metylenblått som ikke oppfyller USP, vanligvis er av tekstilkvalitet og inneholder Azure B, tungmetaller eller rester av løsemidler som forskyver redoksmålinger og gjør endepunkter uklare, uten at noen fargeprotokoll kontrollerer for dette. De fleste selgere som hevder samsvar med USP, tester bare tungmetaller og erklærer seg ferdige. Fullt samsvar omfatter identitet, innholdsbestemmelse, organiske urenheter, rester av løsemidler, elementære urenheter, gløderest, mikrobielle grenseverdier og bakterielle endotoksiner. Hvordan velge metylenblått av farmasøytisk kvalitet gjennomgår hvordan denne dokumentasjonen skal leses. Blupreme samarbeider med en farmasøytisk produsent av metylenblått, tester mot hele USP-spesifikasjonen og publiserer det fullstendige analysesertifikatet (COA). Når fargen er målingen, er den dokumentasjonen en del av instrumentet.