Farging med metylenblått: mikroskopimetoder og et atlas med ekte bilder

Farging med metylenblått gjør ellers svakt synlige celledetaljer lettere å skille fra hverandre i lysfeltmikroskopi. Det kan hjelpe elever og studenter med å finne kjernen i en kinncelle eller undersøke konturene og organiseringen til mikroorganismer. Et blått objekt er imidlertid en observasjon. Å navngi organismen, måle den og avgjøre om den tyder på sykdom er separate oppgaver.

Forsidebildet illustrerer kontrastprinsippet. Atlaset nedenfor inneholder ekte fotografier av prøver som er dokumentert uavhengig av oss, med de opprinnelige kildeopplysningene.

Hva synliggjør metylenblått?

Metylenblått er et basisk fargestoff: Det fargede ionet har positiv ladning. Som OpenStax forklarer i sin gjennomgang av prøvefarging, vekselvirker basiske fargestoffer med negativt ladet cellemateriale og kan få celler til å tre tydelig frem mot en lysere bakgrunn. I egnede preparater fremhever metylenblått områder som er rike på nukleinsyrer, og andre strukturer som binder fargestoffet.

Ved enkel farging gir ett fargestoff kontrast. Flere organismer kan derfor se blå ut uten å være samme organisme. De nyttige spørsmålene er i første omgang beskrivende: Er objektene runde eller avlange, isolerte eller samlet i klynger, jevnt farget eller med synlige indre forskjeller? Se forskjellen mellom enkel farging og gramfarging før du tolker fargen som et klassifiseringsresultat.

Kontrast og oppløsning er forskjellige ting. Kontrast hjelper deg å skille et objekt fra omgivelsene; oppløsning gjør det mulig å skille detaljer som ligger nær hverandre. Et mørkere bilde garanterer ikke at flere strukturer kan skilles fra hverandre. Heller ikke hvert mørkt korn bør betegnes som en organell.

Native preparater, fargede våtpreparater og utstryk

Et ufarget, eller nativt, våtpreparat gir et bilde uten tilsatt fargestoff, selv om det å fjerne prøven fra det opprinnelige miljøet fortsatt endrer den. I et farget våtpreparat tilsettes reagens mens materialet fortsatt ligger i væske under et dekkglass. I et fiksert utstryk fordeles materialet på et objektglass og fikseres med en angitt metode før videre behandling. OpenStax’ oversikt over preparering skiller mellom våtpreparater og fiksering og forklarer hvorfor fikserte organismer ikke lenger gir et bilde av normal bevegelse eller metabolisme.

Disse preparatene besvarer ulike spørsmål:

Ved en sammenligning i undervisningen bør du dokumentere et ufarget preparat før du undersøker et separat farget preparat laget i henhold til undervisningsprotokollen. Hold belysningen og innstillingene for bildeopptak sammenlignbare. Hvis to forskjellige celler fotograferes, beskriv dem som eksempler, ikke som før- og etterbilder av én celle.

Mikroskopiatlas: tre ekte fargede prøver

Dette atlaset er et eget utvalg og en egen tolkning av tre mikroskopibilder med åpne lisenser. Opphavspersonene identifiserer prøvene og fargestoffene. Vi har ikke uavhengig bekreftet identiteten til prøvene deres. Bildene er gjengitt ubeskåret som tapsfrie WebP-konverteringer, uten tilføyde detaljer eller fargeendringer.

Bilde 1: menneskelige kinnceller

Prøve: menneskelige kinnceller. Fargestoff: metylenblått. Forstørrelse: 400×, oppgitt av fotografen. Målestokkstrek: ikke tilgjengelig; kilden oppgir ingen kalibrert pikselstørrelse. Fotografi av Fritzmann2002, 2017, fra Menneskelige kinnceller (farging med metylenblått), lisensiert under CC BY-SA 4.0. Denne gjengivelsen beholder samme lisens.

Begynn med en isolert celle: Den mørkere kjernen er lettere å skille fra det omkringliggende blå cytoplasmaet. Undersøk deretter de overlappende cellene nedenfor. Overlapping gjør en grense vanskeligere å følge og kan skape et lokalt mørkere område. Bruk dette bildet til å øve på å følge konturer, ikke til å telle hver mørke flekk som en kjerne. Veiledningen for observasjon av kinnceller utdyper den prøvespesifikke øvelsen.

Bilde 2: løkceller

Prøve: løkceller, slik kilden identifiserer dem. Fargestoff: metylenblått. Forstørrelse: “200x” står i det opprinnelige filnavnet; den er ikke uavhengig bekreftet. Målestokkstrek: ikke tilgjengelig; ingen kalibrering er oppgitt. Fotografi av Alvy16, 2019, fra Løkcelle 200x, lisensiert under CC BY 4.0.

De avlange rommene danner et ordnet lag. Sammenlign de lange, felles grensene med de uregelmessige konturene i bilde 1. Legg også merke til det tydelige mørke materialet og den ujevne lysstyrken i synsfeltet. Fotografiet fastslår ikke hva hver mørk avleiring er. Det viser hvorfor en nyttig observasjonslogg inkluderer artefakter og usikkerhet i stedet for å sette navn på alt som tar opp farge.

Bilde 3: gjærsopp identifisert av kilden som Candida spp.

Prøve: Candida spp., ifølge fotografen. Fargestoff: enkel positiv farging med metylenblått. Forstørrelse: ikke tilgjengelig. Målestokkstrek: ikke tilgjengelig; ingen kalibrert pikselstørrelse er oppgitt. Fotografi av Marta, Wikimedia-brukeren Martunia.g, 2021, fra Positiv farging med metylenblått 2, lisensiert under CC BY 4.0.

Sammenlign de tette blå klyngene med de mindre tettpakkede randsonene. Konturene til enkeltobjekter er lettere å følge der objektene overlapper mindre. Navnet Candida kommer fra kildeopplysningene, ikke fra en artsidentifikasjon utført på dette fotografiet. Dette bildet gir heller ikke noe resultat om levedyktighet. Analyser av gjærsopps levedyktighet og respirasjon krever egne betingelser, kontroller og tolkninger.

Slik leser du målestokken riktig

Disse bildene gir grunnlag for visuell sammenligning, ikke for målinger i mikrometer eller sammenligning av absolutt cellestørrelse mellom bildene. Oppgitt forstørrelse kan ikke erstatte manglende kamerakalibrering. Når visningsstørrelsen til et bilde endres, endres også den tilsynelatende forstørrelsen.

For dine egne bilder må du etablere en målekalibrering med en kjent standard og det aktuelle optiske oppsettet. Nikons veiledning i mikrometri forklarer hvordan et objektmikrometer omregner vilkårlige inndelinger i et bilde eller et trådkors til fysiske lengder. Registrer objektivet, kamerakonfigurasjonen og kalibreringen, og legg til en målestokkstrek basert på disse dataene. Ikke utled en målestokkstrek fra en læreboks gjennomsnittlige cellestørrelse.

Passer flasken til metoden?

En flaske merket metylenblått er ikke en fullstendig laboratoriespesifikasjon. Kontroller konsentrasjonen og enhetene, løsemiddelet, øvrige ingredienser, tiltenkt bruksområde, batchdokumentasjonen og instruksjonene. Et reagens’ sikkerhetsdatablad beskriver farer; metodeinstruksjonene angir hvordan det skal brukes til den tiltenkte prepareringen.

Et konkret eksempel er Mercks Löfflers metylenblåttløsning. Produsenten angir at dette er et mikroskopireagens og beskriver rollen som kontrastfarge ved syrefast farging. Den oppgitte brannfarligheten viser også hvorfor «en blå væske» ikke er tilstrekkelig informasjon for å planlegge håndtering eller oppvarming. Disse egenskapene gjelder denne formuleringen, ikke automatisk enhver vannbasert metylenblåttløsning.

Tilsvarende er eosin-metylenblått-agar et formulert dyrkningsmedium. Det er ikke en objektglassfarging som lages ved å tilsette rent metylenblått til en prøve. Hvis du har et annet mål for avbildningen, kan du sammenligne alternativer til metylenblått for mikroskopi.

For et mikroskopsett for nybegynnere bør du begynne med den dokumenterte undervisningsmetoden, kjente ferdigpreparerte objektglass og det angitte reagenset. Hvis en flaske har mistet etiketten eller sammensetningen ikke kan fastslås, erstatt den med et egnet, dokumentert reagens. Bruk øyevern og følg håndteringsinstruksjonene som følger med den aktuelle formuleringen. Menneskelig materiale og ukjente miljøprøver krever undervisningslaboratoriets prosedyrer for prøvehåndtering og avfallshåndtering; farging erstatter ikke disse prosedyrene.

Skriv observasjonen før konklusjonen

«Blå ovale objekter i klynger» er en forsvarlig beskrivelse av et bilde. «En bestemt infeksjon» krever dokumentasjon som bildet ikke har gitt. Hold prøvens opprinnelse, preparering, fargereaksjon og identifikasjonsmetode atskilt i notatboken. Dette skillet gjør et enkelt undervisningsbilde nyttig og hindrer at et tiltalende mikroskopibilde brukes som grunnlag for en påstand det ikke kan underbygge.