Hvordan metylenblått kommer inn i celler: reduksjon, reoksidasjon og opptak

Se på en skål med endotelceller som tar opp metylenblått, og den nærliggende tolkningen er også den gale. Mediet mister blåfargen, cellene får blå granuler, så fargestoffet må ha passert gjennom membranen som det blå molekylet. Forsøkene sier noe annet. Den blå formen krysser knapt membranen. Det som krysser, er den fargeløse formen, og det blå du ser inne i cellen, dannes der etter ankomst.

Denne omvendte forklaringen er viktig fordi den avgjør hva fargingen kan og ikke kan fortelle deg. Blå granuler viser oksidert fargestoff som er blitt reoksidert og holdt tilbake i organeller. De viser ikke den totale mengden fargestoff i cellen, de viser ikke den reduserte fraksjonen, og de måler ikke biologisk effekt. For å forstå hvorfor må du følge de tre trinnene: reduksjon på overflaten, diffusjon av den reduserte formen, og reoksidasjon og tilbakeholdelse inne i cellen.

De to formene oppfører seg som forskjellige molekyler

Oksidert metylenblått er et flatt, positivt ladet ringsystem. Det løses opp i vann, absorberer lys sterkt rundt 600 til 700 nanometer og ser blått ut. Ladningen er poenget. Et ladet, vannelskende molekyl glir ikke lett gjennom en lipidmembran, så den presise formuleringen i litteraturen er at membranen er relativt ugjennomtrengelig for det, ikke ugjennomtrengelig.

Redusert metylenblått, kalt leukometylenblått, er fargeløst, uladet og fettløselig. Fjern ladningen, og membranen slutter å være en vegg. Det reduserte molekylet diffunderer lett gjennom, og når det kommer inn i et mer oksiderende rom, kan det avgi elektroner igjen og gå tilbake til den blå, ladede formen som holdes tilbake. Fargestoffets redokskjemi er derfor også transportmekanismen. Endrer du antallet elektroner, endrer du permeabiliteten.

Elektronene til det første trinnet kommer fra cellen selv. Pattedyrceller driver elektrontransport over plasmamembranen og flytter reduksjonsekvivalenter fra intracellulære donorer ut til akseptorer på overflaten. Denne aktiviteten på tvers av plasmamembranen er en normal cellefunksjon som finnes i de fleste celletyper. Reduktasen på endoteloverflaten som håndterer tiazinfargestoffer, oppfører seg som andre reduktaser i én avslørende henseende: Den fortsetter å virke i nærvær av cyanid og azid ved doser som stanser de senere trinnene. Dette skillet er nøkkelen til hele forklaringen.

Fordelingsmodellen kom først og forklarte nesten opptaket

I 1929 stilte Marian Irwin ved Rockefeller Institute et enklere spørsmål. Kanskje fargestoffets inntrenging bare skyldes fordeling mellom vann og cellens fettholdige lag, og et kloroformlag kan fungere som en erstatning for disse lagene på laboratoriebenken. I sine spektrofotometriske studier av inntrenging ristet hun vandige fargestoffløsninger med kloroform og sammenlignet det som gikk over i den organiske fasen, med det som kom inn i levende algeceller.

To funn fra dette arbeidet fortjener fortsatt oppmerksomhet. For det første inneholdt kommersielle løsninger av metylenblått trimetyltionin, nå kalt azure B, og denne urenheten trengte inn raskere enn selve metylenblått, særlig ved alkalisk pH, der den lipidløselige frie baseformen dominerer. Noe av det som så ut som opptak av metylenblått, var i virkeligheten selektivt opptak av azure B. For det andre avgjorde pH utfallet ved å bestemme ioniseringstilstanden, og skadede celler slapp inn langt mer fargestoff enn intakte celler. Fordelingskoeffisienter og ladningstilstand styrte hva henholdsvis det kunstige systemet og den levende cellen tok opp. Likheten mellom de to støttet ideen om ikke-vandige lag ved cellegrensen.

Modellen var forutseende når det gjaldt lipider og ionisering, men den kunne ikke skille mellom et fargestoff som fordeler seg i sin opprinnelige form, og et fargestoff som omdannes kjemisk på overflaten, krysser i forkledning og omdannes tilbake inne i cellen. Dette skillet krevde et annet forsøk, og det kom sytti år senere i lungeendotel.

Reduksjon utenfor, tilbakeholdelse innenfor

Merker og kolleger arbeidet med dyrkede endotelceller fra lungearterier hos storfe og foreslo en sekvens i tre trinn: Det oksiderte fargestoffet reduseres på celleoverflaten til sin fargeløse, lipofile form, den reduserte formen diffunderer inn, og intracellulær reoksidasjon gjendanner den oksiderte formen som ikke kan krysse membranen, og som dermed hoper seg opp. Deres studie av tiazinfargestoffers opptak i endotelceller testet så denne sekvensen ved å forsøke å bryte den på bestemte steder.

Det første verktøyet var ferricyanid, en elektronakseptor som ikke kan komme inn i cellen. Når overflateenzymer reduserer blått fargestoff til den fargeløse formen utenfor cellen, kan ferricyanid ta disse elektronene tilbake og gjendanne blått fargestoff i mediet før det rekker å krysse membranen. Så lenge ferricyanid var til stede i overskudd (10 mikromolar fargestoff mot 50 til 500 mikromolar ferricyanid), stoppet opptaket av fargestoff nesten helt. Først etter at ferricyanidet var brukt opp, fortsatte opptaket med normal hastighet. Kinetikken fortalte det samme på en annen måte. Ferricyanid forsvant med en omtrent konstant hastighet, i tråd med en jevn reduksjonsstrøm på overflaten som forsynte en mediator som kunne brukes om igjen. Samtidig forsvant det ekstracellulære fargestoffet eksponentielt etter hvert som mengden minket. En konstant strøm sammen med en minkende mengde betyr at ferricyanidsignalet viser kontinuerlig reduksjon, ikke fargestoffmolekyler som forlater løsningen.

Det andre verktøyet fjernet selve passasjetrinnet. Gruppen festet toluidinblått O, et nært beslektet tiazinfargestoff, til en stor polyakrylamidkjede som var for stor til å komme inn i cellen i noen av oksidasjonstilstandene. Cellene reduserte likevel det bundne fargestoffet. Reduksjon krever derfor ikke intracellulær tilgang. Maskineriet er eksponert på overflaten eller elektrisk koblet til den.

Så kom skillet som gir artikkelen tittelen. Cyanid og azid ved 2 millimolar hemmet opphopningen av fargestoff kraftig. Under mikroskopet forsvant nesten de mørkeblå og lilla inklusjonene som vanligvis omkranser kjernen. Likevel bremset ingen av hemmerne den ekstracellulære reduksjonen: Ferricyanidsyklusen fortsatte uforminsket, og polymeren som ikke kunne krysse membranen, ble fortsatt redusert. Blokkeringen lå senere i forløpet. Cyanid og azid stanset intracellulær reoksidasjon og tilbakeholdelse, ikke reduksjon på overflaten. Kontroller av levedyktighet støttet denne tolkningen, siden cellene beholdt sitt cytosoliske markørenzym laktatdehydrogenase gjennom disse behandlingene. Tapet av opptak skyldtes dermed ikke bare forgiftning eller membranbrudd.

Ett forbehold fra artikkelen gjelder fortsatt. De blå inklusjonene lå rundt, men ikke i, kjernen, i tråd med oksidasjon inne i subcellulære organeller. Studien identifiserte imidlertid ikke hvilke organeller det var. Lignende mønstre i andre celletyper var blitt kalt lysosomale på tynt grunnlag. Betrakt tilbakeholdelsen som fastslått, men plasseringen som foreløpig. Lesere som følger elektronenes videre ferd, kan gå videre til mitokondriell elektrontransport og redokshåndtering og det bredere bildet av absorpsjon og fordeling etter tilførselsvei.

Farging er ikke eksponering

En tredje studie viser hva som skjer når denne opptaksmekanismen møter en biologisk måling. Scott og kolleger fant at metyl-beta-syklodekstrin, et ringformet sukkermolekyl, binder metylenblått direkte, med en assosiasjonskonstant på rundt 310 per molar for inklusjonskomplekset, mot omtrent 5846 per molar for dimerisering av fargestoffet. I L929-fibroblaster blokkerte denne bindingen både cellefarging og stimulering av glukoseopptak: Forinkubasjon med syklodekstrinet hindret blåfarging, og tilsetning i etterkant fremskyndet avfargingen. Etter hvert som det optiske blåsignalet forsvant fra cellene, avtok den aktiverte glukosetransporten i tett parallell.

Forfatterne tolket denne korrelasjonen som støtte for en direkte interaksjon mellom fargestoffet og et protein i signalveien for aktivering av glukosetransportøren, fremfor en langvarig mekanisme basert på oksidativt stress. Denne slutningen er rimelig, men begrenset. Forsøket identifiserer ikke proteinet, viser ikke binding til selve transportøren, og korrelasjonen mellom avfarging og tap av effekt kan ikke utelukke alle redoksmedierte mekanismer.

Den varige lærdommen handler om måling. Optisk farging viser synlig, oksidert fargestoff som er knyttet til cellene. Den overser den fargeløse, reduserte fraksjonen fullstendig. En blek celle kan derfor fortsatt inneholde fargestoffekvivalenter, mens en sterkt farget celle viser tilbakeholdt, oksidert fargestoff snarere enn total vevseksponering eller effektstørrelse. Det samme forbeholdet gjelder i større skala: Å sammenligne farging på tvers av celletyper, eller å behandle et mørkt vevssnitt som bevis på høyere eksponering, gjentar den opprinnelige feiltolkningen av skålen. Opptak er en syklus av reduksjon, diffusjon og reoksidasjon, og ethvert enkelt øyeblikksbilde av den blå formen viser bare én del av den. De praktiske konsekvensene for farging og håndtering i laboratoriet og for tolkning av påstander om dose og eksponering følger direkte av dette.