L-identifikazzjoni tal-blu tal-metilen fil-laboratorju: spettri infraħomor u metodi komplementari

Immaġina li tliet laboratorji jirċievu l-istess trab blu. L-ewwel wieħed jirreġistra spettru infraħmar u jiddikjara li huwa blu tal-metilen. It-tieni jagħmel kromatografija u jirrapporta 0.4% Azure B. It-tielet jidfratta r-raġġi X mill-kristalli u jidentifika forma idratata. It-tlieta għandhom raġun, iżda ħadd minnhom ma wieġeb iż-żewġ mistoqsijiet l-oħra. Il-konfużjoni tibda meta riżultat wieħed jiġi interpretat daqslikieku jwieġeb it-tlieta.

Dan l-artiklu jifred dawk il-mistoqsijiet. L-identifikazzjoni bl-infraħmar tistabbilixxi l-identità molekulari bi tqabbil ma’ standard ta’ referenza. Il-kromatografija tistabbilixxi l-kompożizzjoni. Id-diffrazzjoni tistabbilixxi l-forma fl-istat solidu. Taqbila li tissodisfa t-test tal-identità mhijiex ċertifikat ta’ purità.

L-identifikazzjoni bl-infraħmar twieġeb mistoqsija waħda sew

It-test tal-identità tal-blu tal-metilen preskritt fil-kompendju huwa tqabbil ta’ spettru ma’ standard, mhux lista ta’ kontroll tal-quċċati. Skont il-previżjoni tal-monografija USP dwar il-blu tal-metilen, l-Identifikazzjoni A tirreferi għall-ispettroskopija infraħamra bl-użu ta’ ottika ATR jew ta’ pillola tal-bromur tal-potassju. L-ispettru tal-kampjun irid jikkorrispondi għall-ispettru tal-istandard ta’ referenza USP, bil-kampjun u l-istandard ippreparati u rreġistrati taħt kundizzjonijiet ekwivalenti. Mhijiex lista fissa ta’ numri tal-mewġ dijanjostiċi li tiddetermina l-konklużjoni. Hija s-sovrappożizzjoni tal-ispettri li tagħmel dan.

Din l-għażla fid-disinn tat-test tirrifletti kif iġibu ruħhom l-ispettri FTIR tal-blu tal-metilen. L-aktar karatteristiċi qawwija jinsabu fir-reġjun tal-marka tas-swaba’. L-assenjazzjonijiet fil-letteratura konsistentement iqiegħdu l-faxxa prinċipali taċ-ċrieki konjugati qrib 1590 sa 1600 cm-1, fejn il-modi ta’ tiġbid aromatiċi tal-karbonju-karbonju u tal-karbonju-nitroġenu jkunu akkoppjati. Faxex oħra qrib 1490 u 1390 cm-1 għandhom karattru ta’ deformazzjoni taċ-ċrieki, tal-karbonju-nitroġenu u tal-karbonju-idroġenu. Il-faxex qrib 1355 u 1330 cm-1 jinvolvu r-rabtiet karbonju-nitroġenu tal-gruppi dimetilamino u d-deformazzjonijiet tal-gruppi metil. Il-karatteristiċi qrib 1225 sa 1250 cm-1 jappartjenu għall-qafas eteroċikliku, filwaqt li l-faxex qrib 1170 sa 1130 u 1066 cm-1 għandhom karattru tal-karbonju-kubrit, b’liwi aromatiku C-H qrib 880 cm-1. Il-modi ta’ tiġbid jidhru f’numri tal-mewġ ogħla: C-H aromatiku qrib 3040 cm-1 u C-H ta’ N-metil bejn madwar 2900 u 3000 cm-1. L-assenjazzjonijiet ippubblikati jvarjaw fid-dettall għax l-iskeletru tal-fenotijażinju jivvibra bħala sistema akkoppjata, għalhekk kwalunkwe tabella individwali ta’ assenjazzjonijiet għandha titqies bħala waħda rrappurtata, mhux bħala l-unika waħda possibbli.

Żewġ effetti tal-preparazzjoni jistħoqqilhom attenzjoni għax ibiddlu l-ispettri IR tal-blu tal-metilen mingħajr ma jbiddlu ż-żebgħa. L-ewwel, il-materjal idratat juri medda wiesgħa O-H madwar 3300 sa 3500 cm-1 flimkien ma’ liwi tal-ilma qrib 1630 sa 1640 cm-1, u forom idratati differenti jċaqilqu l-faxex tal-marka tas-swaba’ b’mod li jista’ jitkejjel. It-tieni, il-matriċi tal-pillola KBr hija igroskopika: l-umdità assorbita tipproduċi faxex eżattament f’dawk ir-reġjuni tal-ilma u tista’ tidher qisha ilma ta’ idratazzjoni mill-kampjun. It-teħid ta’ kampjuni bl-ATR jevita l-matriċi KBr, iżda l-intensitajiet ATR ivarjaw skont il-fond tal-penetrazzjoni, li jiddependi min-numru tal-mewġ, għalhekk spettru ATR u spettru ta’ trażmissjoni tal-istess trab ma jistgħux jiġu sovrapposti direttament. Ir-regola prattika toħroġ mir-rekwiżit tal-kompendju: qabbel il-kampjun u r-referenza rreġistrati bl-istess teknika, u ddokumenta liema teknika ntużat. Għall-kimika bażika tal-katjon, tal-melħ u tal-idrati wara dawn l-ispettri, ara r-referenza dwar l-istruttura u l-proprjetajiet tal-blu tal-metilen.

Tabella għall-għażla tal-metodu analitiku

Din it-tabella hija l-għodda tal-għażla. Aqra kull ringiela biex issib liema mistoqsija jwieġeb metodu, x’jistabbilixxi riżultat li jissodisfa t-test u x’jibqa’ mhux ippruvat.

Għaliex taqbila bl-infraħmar mhijiex ċertifikat ta’ purità

Taqbila tal-identità teskludi li tkun iż-żebgħa żbaljata. Ma tagħtix inventarju tal-kampjun. Tliet limitazzjonijiet huma l-aktar importanti.

L-ewwel, sustanzi relatati mill-qrib jixxiebhu fl-infraħmar. Azure B ivarja mill-blu tal-metilen bi grupp metil wieħed, għalhekk l-ispettru tiegħu jixbah ħafna dak tal-blu tal-metilen. Taħlita li fiha ftit fil-mija Azure B xorta tissovrappożizzjona sew ma’ referenza tal-blu tal-metilen. Is-sejbien ta’ dik l-impurità huwa xogħol għall-kromatografija, kif spjegat fil-gwida dwar l-impuritajiet tal-blu tal-metilen u l-metodi tal-ittestjar.

It-tieni, l-ispettroskopija infraħamra hija teknika li tanalizza l-materjal kollu flimkien, b’sensittività limitata għall-komponenti preżenti fi kwantitajiet żgħar. Ammonti żgħar ta’ żebgħat relatati, solventi residwi jew residwi inorganiċi jinħbew taħt il-faxex ewlenin. In-nuqqas ta’ quċċati żejda huwa evidenza dgħajfa tan-nuqqas ta’ impuritajiet.

It-tielet, l-istandard ta’ referenza jirregola t-tqabbil kollu. Standard degradat, bi spettru mċaqlaq minħabba l-idratazzjoni jew immaniġġjat ħażin ibiddel il-bażi tat-tqabbil. L-istess jiġri meta jintużaw tekniki mhux imqabbla sew, bħal meta spettru ATR ta’ kampjun jiġi ġġudikat kontra referenza KBr. Irreġistra l-lott tal-istandard, it-teknika u l-preparazzjoni ma’ kull konklużjoni.

It-taħlitiet iżidu twissija finali. Spettru li fil-biċċa l-kbira jaqbel, iżda għandu spallejn jew anomaliji fl-intensità, mhuwiex riżultat li għadda b’noti f’qiegħ il-paġna. Huwa sinjal biex jiġu separati l-komponenti tal-kampjun qabel l-identifikazzjoni.

Metodi komplementari fil-prattika

L-HPLC tal-blu tal-metilen jagħti t-tweġiba dwar il-kompożizzjoni li l-infraħmar ma jistax jagħti. Il-metodu attwali tal-kompendju juża kolonna tat-tip fenil bi gradjent ta’ ilma u aċetonitril li fih aċidu trifluworoaċetiku, u jagħmel id-detezzjoni f’246 nm, mhux fil-faxxa viżibbli. L-identità tiġi mill-korrispondenza tal-ħin taż-żamma mal-istandard ta’ referenza; l-istess tqabbil jipprovdi l-analiżi kwantitattiva. It-test tal-impuritajiet organiċi jidentifika Azure B bil-materjal ta’ referenza tiegħu stess f’żamma relattiva qrib 0.8, meta mqabbla ma’ 1.0 għall-blu tal-metilen, u jeħtieġ riżoluzzjoni għolja bejn iż-żewġ quċċati. Innota l-għażla tat-tul tal-mewġa: is-serje tad-demetilazzjoni tassorbi progressivament aktar lejn l-aħmar, mit-tjonina qrib 600 nm, permezz ta’ Azure C, Azure A u Azure B, sal-blu tal-metilen qrib 670 nm. Għalhekk detettur fiss qrib 660 nm jirrispondi b’mod mhux ugwali tul is-serje u jissottovaluta xi omologi. Meta tkun meħtieġa karatterizzazzjoni sħiħa tas-serje kollha, din għandha ssir b’metodu C18 LC-MS/MS bi standards ikkwalifikati għal kull analit.

Id-diffrazzjoni tat-trab twieġeb il-mistoqsija dwar l-istat solidu li ż-żewġ metodi ta’ hawn fuq jeqirdu jew jinjoraw: meta t-trab jinħall għall-kromatografija, tintilef l-informazzjoni dwar il-kristalli, u l-vibrazzjonijiet molekulari jirrapportaw dwar ir-rabtiet aktar milli dwar l-arranġament fuq medda twila. Il-mudelli ta’ diffrazzjoni jiddistingwu l-fażijiet idratati u l-kristallinità, u l-blu tal-metilen jeħtieġ dan l-eżami aktar mill-biċċa l-kbira tal-materjali. Ix-xogħol fuq l-istat solidu ta’ Rager u l-kollegi identifika ħames strutturi idratati distinti, fosthom pentaidrat, żewġ diidrati, monoidrat u idrat intermedju, u ma sab ebda triidrat veru fost il-forom ikkaratterizzati. L-immaniġġjar fil-laboratorju huwa importanti hawnhekk: l-umdità u t-temperatura jbiddlu l-istabbiltà tal-idrati, u tħin aggressiv jista’ jbiddel il-fażi jew inaqqas il-kristallinità. Għalhekk, ikkontrolla u ddokumenta l-umdità relattiva u t-temperatura, u żomm it-tħin għall-minimu. It-tikkettar tal-idrati u l-effett tiegħu fuq il-massa miżuna huma diskussi aktar f’forom idratati tal-blu tal-metilen u t-tikkettar.

L-assorbiment UV-Vis għandu rwol ta’ appoġġ. Il-massimi magħrufa jikkonfermaw l-imġiba mistennija tas-soluzzjoni u jippermettu xogħol fuq il-konċentrazzjoni, iżda soluzzjoni blu li tassorbi fit-tul tal-mewġa mistenni hija konsistenti mal-blu tal-metilen mingħajr ma tipprova l-identità tiegħu, għax żebgħat relatati jassorbu fil-qrib.

X’għandek tistaqsi qabel tixtri

Ibdel dawn id-distinzjonijiet f’mistoqsijiet għax-xiri. Staqsi liema lott ġie ttestjat, liema teknika stabbiliet l-identità, jekk it-test tal-impuritajiet bl-HPLC użax il-materjal ta’ referenza Azure B, u jekk il-forma idratata ġietx ikkaratterizzata jew sempliċement preżunta. Fuq kollox, staqsi jekk iċ-ċertifikat ikoprix l-ispeċifikazzjoni sħiħa jew biss testijiet magħżula. Ħafna bejjiegħa li jiddikjaraw konformità mal-kompendju jittestjaw biss il-metalli tqal, u b’hekk iħallu bla tweġiba l-mistoqsijiet dwar l-identità, il-kontenut kwantitattiv, l-impuritajiet organiċi, is-solventi u l-mikrobi.

Blupreme jittestja l-ispeċifikazzjoni sħiħa USP, li tkopri l-identità, il-purità, l-impuritajiet organiċi, is-solventi residwi, l-impuritajiet elementali, ir-residwu wara t-tqabbid, il-limiti mikrobiċi u l-endotossini batteriċi, fi sħubija ma’ manifattur farmaċewtiku tal-blu tal-metilen. Iċ-ċertifikat pubbliku ta’ analiżi għal kull lott jiġi ppubblikat fuq l-ittestjar tal-kwalità ta’ Blupreme, sabiex il-bażi tal-analiżi kwantitattiva u r-riżultati tal-impuritajiet ikunu jistgħu jinqraw direttament minflok jiġu dedotti. Riżultati qrib 100% xorta jeħtieġu li tiġi ddikjarata l-bażi tal-kalkolu tagħhom, kif tispjega l-gwida dwar riżultati tal-analiżi kwantitattiva ’l fuq minn 100 fil-mija. It-taqbila tal-identità tiftaħ l-investigazzjoni. Id-dokumentazzjoni sħiħa tagħlaqha.