Mengapa penyerapan metilena biru berubah mengikut kepekatan

Ambil sebotol larutan stok metilena biru dan tuangkannya ke dalam dua gelas. Isi gelas pertama dengan larutan stok dan gelas kedua dengan larutan yang dicairkan sepuluh kali ganda. Gelas kedua lebih pucat, seperti yang dijangka. Perhatikan dengan teliti dan anda akan mendapati sesuatu yang lain turut berubah. Ronanya telah beralih. Satu larutan cenderung ke arah biru langit yang jernih, manakala satu lagi ke arah biru berona ungu. Pencairan bukan sekadar mengurangkan keamatan. Ia mengubah spesies kimia yang paling banyak menyerap.

Konsep di sebalik perubahan ini mudah. Metilena biru terlarut bukan hanya satu spesies. Kation pewarna tunggal, yang dipanggil monomer, boleh bertindan muka ke muka dengan kation kedua untuk membentuk dimer, dan dimer boleh membentuk agregat yang lebih besar. Setiap bentuk mempunyai spektrum penyerapan tersendiri. Bacaan yang dilaporkan oleh spektrofotometer ialah jumlah sumbangan campuran yang terdapat dalam kuvet itu, pada keadaan tersebut. Apabila campuran berubah, spektrum turut berubah, walaupun jumlah kandungan pewarna mengikut nisbah pencairan yang tetap.

Monomer dan dimer ialah penyerap yang berbeza

Bayangkan monomer sebagai sekeping kad rata dengan cas positif yang tersebar merentasi sistem cincinnya. Dua kad sedemikian boleh bertindan muka ke muka. Cas positif saling menolak, tetapi permukaan aromatik yang rata saling menarik melalui interaksi penindanan, sementara air dan ion lawan di sekelilingnya menyaring tolakan itu. Hasilnya ialah pasangan terikat dengan keadaan elektronik yang dikongsi. Peralihan yang dibenarkan bagi pasangan ini berada pada tenaga yang lebih tinggi berbanding peralihan monomer, maka jalur dimer muncul pada panjang gelombang yang lebih pendek daripada jalur monomer, sementara agregat yang lebih besar menyumbang lebih jauh ke arah bahagian biru sebagai bahu spektrum.

Pada kepekatan yang sangat rendah dalam air bersih, monomer mendominasi dan jalur panjang gelombang yang lebih panjang juga mendominasi. Apabila kepekatan keseluruhan meningkat, bahagian bentuk berpasangan semakin bertambah dan jalur panjang gelombang yang lebih pendek semakin besar berbanding jalur pertama. Oleh itu, nisbah kedua-dua jalur menunjukkan komposisi campuran, bukan kepekatan keseluruhan secara langsung. Bacaan pada satu panjang gelombang sahaja tidak dapat memisahkan kedua-duanya tanpa andaian tentang bentuk yang hadir.

Inilah sebabnya spektrum rujukan mesti sentiasa disertakan dengan keadaan pengukuran. Rujukan spektrum metilena biru menyenaraikan kedudukan jalur bersama pelarut, latar garam, pH, suhu dan julat kepekatan yang menghasilkan jalur tersebut. Jika nilai puncak dipetik tanpa keadaan itu, maklumat yang menyertai nilai tersebut tidak lengkap. Dua makmal boleh sama-sama betul tentang spektrum yang berbeza daripada pewarna yang sama kerana mereka mengukur campuran yang berbeza.

Faktor yang mengubah keseimbangan

Kepekatan ialah faktor utama. Pembentukan dimer memerlukan dua monomer bertemu, jadi bahagiannya meningkat lebih cepat daripada hubungan linear dengan jumlah keseluruhan pewarna. Pemalar pendimeran dalam air yang dilaporkan berada pada nilai ribuan per molar berhampiran suhu bilik, maka bahagian dimer meningkat dengan mendadak dalam julat micromolar. Pemadanan global yang luas, merangkumi pewarna pada julat micromolar hingga millimolar, mendapati sumbangan tetramer yang bukan sifar sudah wujud di bawah 34 micromolar. Ini memberi amaran agar tidak bergantung sepenuhnya pada pemadanan yang terhad kepada dua spesies pada kepekatan puluhan micromolar. Pecahan tepat bergantung pada medium, sebab itulah artikel ini menerangkan arah perubahan dan bukannya memberikan jadual penukaran sejagat.

Garam ialah faktor kedua. Ion terlarut menyaring tolakan antara dua kation, maka penambahan natrium klorida dan elektrolit seumpamanya mengalihkan campuran ke arah dimer dan agregat pada kepekatan pewarna yang sama. Kesan ini dapat dilihat dalam kajian pengagregatan metilena biru dalam medium salin dan berair, yang mengukur pewarna daripada kira-kira 1 micromolar hingga 3.4 millimolar merentasi kepekatan natrium klorida 0 hingga 0.15 molar. Dalam pemadanan itu, pecahan tetramer mencapai kira-kira 0.93 pada keadaan pewarna tinggi dan garam tinggi. Oleh itu, spektrum yang direkodkan dalam air dan spektrum yang direkodkan dalam larutan salin fisiologi tidak boleh digunakan sebagai piawai yang saling menggantikan.

Suhu bertindak ke arah yang bertentangan. Penindanan membebaskan air terikat dan ditentang oleh gerakan terma, maka pemanasan larutan lazimnya memisahkan sebahagian dimer kembali menjadi monomer, sementara penyejukan menggalakkan penggabungan. Entalpi penceraian hasil pemadanan adalah negatif, kira-kira negatif 30 kilojoules per mole merentasi 282 hingga 333 kelvin, yang mengesahkan penggabungan eksotermik. Sampel sejuk yang diukur sejurus selepas dikeluarkan dari peti sejuk boleh kelihatan lebih teragregat berbanding sampel yang sama selepas mencapai keseimbangan pada suhu bilik.

Pelarut menentukan keadaan asas. Air, dengan kesan hidrofobiknya yang kuat, menggalakkan kation pewarna yang rata untuk bertindan. Alkohol seperti etanol dan metanol mensolvatkan cincin dengan lebih baik dan memecahkan agregat, maka pada kepekatan pewarna yang sama, bentuk monomer lebih dominan dalam etanol berbanding dalam air. Kopelarut aprotik memberikan kesan yang sama: dalam campuran air dan DMSO pada 293 kelvin, penambahan DMSO menekan pendimeran, yang menunjukkan struktur air sebagai pendorong penindanan. Surfaktan memerlukan perhatian kerana kesannya boleh berlaku dalam kedua-dua arah. Di atas kepekatan misel kritikalnya, misel boleh melarutkan monomer secara individu dan memulihkan spektrum yang menyerupai monomer. Di bawah tahap itu, surfaktan bercas bertentangan boleh menggalakkan penindanan: pada kepekatan pewarna 100 micromolar, pempolimeran yang didorong oleh SDS mencapai puncak berhampiran 4 millimolar SDS, kira-kira separuh daripada ambang pembentukan misel, sebelum pengagihan semula berlaku pada tahap surfaktan yang lebih tinggi. Kajian tentang kesan interaksi pewarna-pelarut dan medium tersusun terhadap spektrum metilena biru menunjukkan betapa kuatnya persekitaran molekul setempat, bukan sekadar kepekatan pukal, menentukan jalur yang diperhatikan.

pH berpengaruh terutamanya pada keadaan ekstrem. Dalam julat hampir neutral yang digunakan dalam kebanyakan kerja makmal, metilena biru kekal dalam bentuk kationik birunya yang biasa, dan pengagregatan mendominasi perubahan spektrum. Asid atau bes yang kuat, kimia redoks yang menghasilkan bentuk leuko tanpa warna, atau pengikatan pada protein dan zarah masing-masing menambahkan keadaan di luar pasangan monomer-dimer. Apabila spektrum berubah selepas penambahan penimbal, semak komposisi penimbal untuk garam dan komponen pengikat sebelum mengaitkan semuanya dengan pH sahaja. Rujukan kimia dan pemprotonan memisahkan persoalan identiti ini daripada persoalan pengagregatan yang dibincangkan di sini.

Mengapa garis lurus Beer-Lambert melengkung

Hubungan Beer-Lambert menyatakan bahawa absorbans bersamaan dengan daya serap didarab dengan kepekatan dan panjang laluan. Ia ialah hukum pengiraan bilangan. Hukum ini mengandaikan objek yang dikira kekal sama apabila bilangannya berubah: satu spesies penyerap, spektrum tetap, tiada perubahan kimia mengikut kepekatan, cahaya pengukuran monokromatik, tiada penyerakan atau pemancaran semula, dan cahaya benar-benar melalui laluan yang dinyatakan.

Pengagregatan melanggar andaian pertama. Secara formal, jumlah absorbans kekal sebagai jumlah sumbangan semua spesies: panjang laluan didarab dengan daya serap setiap spesies dan kepekatan spesies itu sendiri. Setiap spesies mematuhi hukum tersebut. Campuran tidak mematuhinya kerana kepekatan spesies ialah fungsi tak linear bagi jumlah keseluruhan pewarna. Oleh itu, lengkung penentukuran absorbans pada jalur monomer berbanding jumlah keseluruhan pewarna bermula sebagai garis lurus dalam had cair, kemudian melengkung ke bawah apabila kepekatan meningkat, kerana setiap tambahan kepekatan membawa bahagian monomer yang secara relatif lebih kecil. Lengkung yang dibaca pada jalur dimer melengkung ke arah yang bertentangan. Kajian pengagregatan mengenal pasti mekanisme ini sebagai punca penyimpangan Lambert-Beer yang diperhatikan. Memadankan garis lurus merentasi kawasan melengkung dan mengekstrapolasikannya ialah kesilapan yang lazim. Garis itu hanya sah dalam julat dan matriks tempat ia dibina.

Pencairan mewujudkan perangkap yang berkaitan. Mencairkan larutan stok pekat untuk mencapai julat instrumen tidak mengekalkan nisbah spesies. Larutan cair dalam kuvet mencapai semula keseimbangan yang lebih memihak kepada monomer, maka spektrumnya menerangkan sampel cair dengan betul tetapi tidak menggambarkan larutan stok dengan betul. Mengira semula spektrum larutan stok dengan menskalakan absorbans ke atas hanya memulihkan anggaran jumlah kandungan jika penentukuran sudah mengambil kira perubahan itu. Langkah tersebut tidak pernah memulihkan bentuk jalur asal. Sesiapa yang membandingkan spektrum larutan pekat dengan rujukan cair sedang membandingkan dua campuran yang berbeza.

Panjang laluan ialah sebahagian daripada hasil

Absorbans berkadar dengan jarak yang dilalui cahaya melalui sampel. Kuvet 10 mm memberikan absorbans sepuluh kali ganda berbanding kuvet 1 mm yang mengandungi larutan yang sama. Penskalaan itu tepat hanya untuk larutan yang sama, dan pengagregatan menjadikan syarat tersebut sangat penting.

Dalam amalan, panjang laluan ialah alat untuk memastikan pengukuran kekal dalam julat yang sah. Laluan panjang memberikan kepekaan untuk larutan cair yang kebanyakannya terdiri daripada monomer. Laluan pendek memastikan bacaan sampel pekat kekal dalam skala tanpa langkah pencairan besar yang akan menetapkan semula keseimbangan. Program kajian pengagregatan yang menghasilkan angka di atas menggunakan pendekatan ini: sel 1 centimeter untuk pewarna 1.1 hingga 34 micromolar, dan sel 0.01 centimeter untuk 94 micromolar hingga 3.4 millimolar. Tapak pengukuran mikroisipadu dan pembaca plat menambahkan geometri tersendiri, dengan laluan pendek yang kadangkala berubah-ubah serta permukaan tempat pewarna kationik boleh terjerap. Laporkan panjang laluan bersama nilai bacaan, sebagaimana rujukan spektrum melaporkan pelarut dan garam. Absorbans tanpa panjang laluan bukanlah suatu hasil. Ia sekadar khabar angin.

Disiplin pengukuran berpandukan mekanisme tersebut. Biarkan sampel mencapai keseimbangan pada satu suhu sebelum mengambil bacaan. Gunakan jenis dan orientasi kuvet yang sama, blanko sepadan yang mengandungi latar garam dan penimbal yang sama, serta peralatan kaca yang bersih, kerana metilena biru terjerap pada kaca dan plastik, dan kuvet bernoda membawa kesan tinggalan sampel pekat sebelumnya. Ambil bacaan dengan segera selepas penyediaan apabila kinetik pengagregatan penting, dan bina setiap lengkung penentukuran dalam matriks yang sama serta pada panjang laluan yang sama seperti sampel yang tidak diketahui kepekatannya. Untuk pemeriksaan visual, ingat bahawa mata ialah spektrometer yang lemah. Sama ada warna larutan boleh menentukan ketulenan ialah persoalan berasingan yang jawapannya tidak, dan perubahan rona akibat pengagregatan ialah salah satu sebabnya.

Rajah untuk diletakkan di sebelah instrumen

Rajah di bawah merangkumkan artikel ini menjadi satu rujukan di meja makmal. Tiga larutan mengandungi pewarna yang sama tetapi berbeza dari segi kepekatan keseluruhan dan latar garam. Spektrum skematiknya menunjukkan bahagian jalur monomer pada panjang gelombang yang lebih panjang berkurang, sementara bahagian jalur dimer pada panjang gelombang yang lebih pendek bertambah apabila penindanan meningkat. Keadaan pengukuran dicetak pada rajah kerana tanpanya, lengkung tersebut tidak boleh digunakan semula. Untuk kedudukan jalur yang diukur pada keadaan yang dinyatakan, gunakan rujukan spektrum. Untuk mengetahui bagaimana pewarna memasuki sel setelah berada dalam larutan, lihat kemasukan ke dalam sel melalui penurunan dan pembahagian. Untuk mengetahui bagaimana dos cahaya dan geometri turut membentuk bacaan fotokimia, lihat pendedahan cahaya dan geometri pengukuran.

Prinsip yang perlu diingat mempunyai dua bahagian. Spektrum mengenal pasti campuran yang hadir dalam kuvet pada keadaan yang dinyatakan. Hanya penentukuran yang dibina pada keadaan yang sama boleh menukarkan absorbans kepada kepekatan keseluruhan.