Paul Ehrlich dan biru metilena: bagaimana pewarna membantu membentuk penemuan ubat

Sumbangan Paul Ehrlich kepada perubatan bukanlah sejenis ubat. Sumbangannya ialah hujah tentang cara meneliti ubat.

Pada 1878, beliau menyerahkan tesis kedoktoran yang bahagian pembukaannya bertajuk "Konsep Kimia Pewarnaan." Hujahnya ialah pewarnaan keratan tisu dan pencelupan sehelai kain mengikut logik yang sama. Dalam kedua-duanya, warna melekat kerana afiniti kimia antara pewarna dengan bahan, bukan kerana tisu itu menyerap, berminyak atau berbentuk sedemikian rupa sehingga memerangkap pigmen. Ehrlich membesar sambil memerhatikan sepupunya, ahli patologi Karl Weigert, menyediakan keratan berwarna. Yang menarik perhatiannya bukanlah imej itu, tetapi hakikat bahawa pewarna memilih tempat untuk dituju.

Dakwaan itu kedengaran sederhana. Sebenarnya tidak. Jika pewarna mengikat pada tisu atas sebab kimia, maka corak pewarnaan ialah laporan tentang kimia tisu tersebut. Slaid berwarna tidak lagi sekadar ilustrasi, tetapi menjadi suatu pengukuran.

Beliau segera mengembangkan idea itu. Pada 1880, beliau menggabungkan biru metilena dengan fuksin asid dan menamakan campuran itu pewarna neutral, neutralen Farbkörper, yang membezakan jenis-jenis sel darah putih apabila pewarna tunggal yang digunakan ketika itu tidak dapat berbuat demikian. Dua tahun kemudian, beliau membentangkan kaedah metil ungu untuk mewarnakan basil tuberkel, dan Koch menggunakan prosedur itu dalam penyelidikannya sendiri.

Teori yang kemudian memberikan asas bersama kepada amalan-amalan ini ialah perkara yang berasingan, dan garis masanya sering diringkaskan sehingga mengaburkan perbezaan tersebut. Teori rantai sisi Ehrlich, iaitu idea bahawa sesuatu bahan bertindak pada sel kerana kedua-duanya serasi secara kimia, berasal daripada tahun-tahun 1890-an, bukan zaman eksperimen pewarna itu. Penyelidikan awal tersebut memberikan keyakinan yang mendahuluinya: keselektifan bersifat kimia, dan oleh itu boleh dicari secara sengaja, bukan ditemui secara kebetulan.

Eksperimen yang menjadikan pewarna sebagai peta

Pada 1885, Ehrlich menerbitkan monograf tentang keperluan oksigen organisma, dengan subtajuk yang menyifatkannya sebagai kajian analisis warna. Kaedahnya ialah menyuntik pewarna yang warnanya bergantung pada keadaan pengoksidaan, kemudian membandingkan cara organ yang berbeza menurunkan atau mengekalkan pewarna tersebut. Pewarna itu digunakan sebagai alat, sebagaimana termometer digunakan: ia memberikan maklumat tentang keadaan dalam tisu yang tidak dapat diperiksa secara langsung. Ehrlich sendiri menyatakan bahawa tujuannya adalah untuk menentukan kuasa penurunan organ hidup dengan bantuan pewarna tertentu.

Hasil berkaitan biru metilena muncul pada 1886, dalam makalah tentang tindak balas pewarna itu dengan bahan saraf hidup, yang dibacakan kepada sebuah persatuan perubatan pada Disember sebelumnya. Biru metilena dimasukkan ke dalam peredaran darah haiwan hidup, kemudian hirisan tisu yang nipis dikeluarkan dan didedahkan kepada udara supaya pewarna tidak berwarna yang terkumpul teroksida semula menjadi biru dan menunjukkan tempat ia terkumpul. Sel saraf dan gentian saraf mengambil warna itu, dengan keselektifan yang mencukupi sehingga teknik tersebut menjadi kaedah piawai untuk memperlihatkan tisu saraf. Sebatian itu bukan lagi sekadar bahan pewarna yang disapu pada keratan mati di atas meja makmal. Ia menjadi penanda yang tersebar di dalam tubuh hidup, dan taburannya dapat ditafsirkan.

Sifat yang mendasari kedua-dua eksperimen ini perlu dinyatakan dengan jelas, kerana segala-galanya dalam kisah ini bergantung padanya. Biru metilena boleh berubah secara berbalik. Bentuk terturunnya, biru leukometilena, tidak berwarna, dan apabila bersentuhan dengan oksigen, ia kembali menjadi kation biru. Larutan glukosa yang mengandungi pewarna itu di dalam balang tertutup tidak berwarna; apabila balang dibuka, larutan itu menjadi biru. Ehrlich dilaporkan telah menunjukkan perkara ini secara langsung dengan merawat keratan berwarna menggunakan klorida besi serta udara, lalu memerhatikan warna itu kembali. Pewarna yang berubah warna mengikut keadaan redoks persekitarannya ialah prob untuk persekitaran tersebut.

Jadi, dua sifat wujud bersebelahan. Pewarna boleh membezakan satu tisu daripada tisu yang lain. Dan warna pewarna boleh diaktifkan dan dinyahaktifkan melalui perubahan keadaan pengoksidaan.

Jika ditelusuri semula dari perkembangan kemudian, sifat kedua itu merupakan permulaan kemoterapi. Jika sesuatu sebatian mengikat pada satu jenis tisu tetapi tidak pada jenis yang lain, maka sebatian yang sama mungkin dapat mencapai satu jenis organisma tetapi tidak yang lain. Ehrlich menyatakan inferens itu secara langsung: jika patogen boleh diwarnakan secara selektif, pewarnaan itu mungkin menunjukkan kesan memudaratkan yang khusus terhadap patogen tersebut. Oleh itu, pewarna mungkin boleh digunakan sebagai ubat yang menyasarkan organisma penceroboh, bukannya pesakit.

Ujian pertama pada pesakit bukanlah untuk malaria. Pada 1890, bersama pakar psikiatri Arthur Leppmann, Ehrlich melaporkan bahawa biru metilena melegakan kesakitan dalam keadaan neuralgia dan reumatik yang melibatkan otot, sendi dan tendon. Kedua-duanya membincangkan sama ada ubat itu mungkin bertindak pada penyakit mental, lalu memutuskan untuk tidak mencubanya. Seorang doktor Itali, Pietro Bodoni dari Genoa, tetap meneruskannya. Tajuk makalahnya pada 1899 merujuk kepada tindakan sedatif dalam pelbagai bentuk psikosis: beliau menghuraikan kesan menenangkan pada empat belas pesakit yang gelisah, dan menyatakan bahawa doktor lain di Genoa sudah menggunakan pewarna itu untuk tujuan yang sama. Sedasi bukanlah kesan terhadap penyakit itu sendiri, dan perbezaan ini terus muncul sepanjang sejarah ini.

Penyelidikan malaria menyusul pada 1891, bersama ahli patologi Paul Guttmann, di hospital Moabit di Berlin. Biru metilena diberikan kepada dua pesakit, dan laporannya diterbitkan dalam Berliner klinische Wochenschrift bertarikh 28 September 1891. Dalam kes pertama, pesakit mengambil 0.5 g pewarna itu sekali gus pada petang 29 Jun; serangan yang dijangka tidak berlaku sepenuhnya, dan satu-satunya aduan yang direkodkan selepas itu ialah stranguri ringan dengan air kencing berwarna biru. Serangan demam hilang dalam beberapa hari pertama, dan parasit tidak lagi terdapat dalam darah selewat-lewatnya pada hari kelapan. Rumusan penulis sendiri ialah jangkaan mereka telah dipenuhi sepenuhnya. Dua kes tanpa kawalan bukanlah bukti yang meyakinkan. Huraian lebih lengkap tentang biru metilena dan malaria, termasuk ujian moden, dibincangkan pada halaman tersendiri. Persoalan yang menarik di sini lebih khusus: sejauh mana penaakulan Ehrlich masih bertahan apabila diuji terhadap parasit.

Bahagian penaakulan yang bertahan dan yang gagal

Tidak banyak daripada mekanisme itu bertahan, sekurang-kurangnya bukan dalam bentuk yang dicadangkan Ehrlich. Penjelasan yang kemas, iaitu kation trisiklik rata menyelit di antara pasangan bes DNA parasit, tidak dapat dipertahankan bagi Plasmodium. Biru metilena begitu mudah diturunkan oleh sel darah merah yang dijangkiti sehingga ia tidak sampai kepada parasit dalam bentuk kation satah sama sekali, dan penjelasan interkalasi yang sesuai untuk pewarna akridina tidak sesuai untuk pewarna ini.

Penjelasan yang disokong oleh bukti lebih rumit. Biru metilena merencat reduktase glutation parasit pada kepekatan yang boleh dicapai dalam tubuh pesakit. Ia menyekat penukaran hem kepada hemozoin, pigmen lengai yang dibentuk oleh parasit untuk mengelakkan keracunan akibat pencernaan hemoglobinnya sendiri, dengan keberkesanan yang hampir sama dengan klorokuin dan jauh lebih tinggi daripada kuinin. Kitaran redoksnya juga menghasilkan spesies oksigen reaktif dalam sel yang sudah pun menghasilkannya. Mekanisme yang manakah sebenarnya berperanan, atau sama ada semuanya menyumbang, masih belum dipastikan.

Terdapat satu lagi kerumitan, dan hal ini patut mempengaruhi cara sebarang dakwaan sejarah tentang sebatian ini ditafsirkan. Biru metilena komersial pada zaman itu bukanlah satu bahan sahaja. Sampel mengandungi azure B, kongener yang mengalami satu penyahmetilan, dan larutan yang lebih lama mengumpulkan lebih banyak bahan ini. Azure B ialah pewarna metakromatik dengan sasaran yang berbeza: ia mewarnakan DNA dwirantai menjadi biru tua dan RNA menjadi hijau. Campuran dua pewarna yang menuju ke tempat berbeza, dalam nisbah yang tidak direkodkan oleh sesiapa, tidak dapat menyokong pernyataan yang jelas tentang tindakan biru metilena di dalamnya.

Pewarna itu sendiri tidak pernah menggantikan kuinin. Kaedahnya lebih berjaya. Murid Ehrlich, Wilhelm Roehl, yang bekerja untuk gabungan industri pewarna dan ubat IG Farben, terus mengembangkan derivatif pewarna sebagai ubat tropika dan menyediakan alat yang selama itu tiada: burung kenari yang dijangkiti malaria burung sebagai saringan rutin bagi sebatian calon. Werner Schulemann kemudian mengubah rantai sisi, dan garam fenotiazinium yang terhasil menyembuhkan jangkitan eksperimen itu. Ia masih menyebabkan pesakit menjadi biru.

Hasil yang bertahan ternyata bukanlah pewarna itu atau sistem cincinnya, tetapi rantai sisinya. Penambahan kumpulan dialkilaminoalkilamino mengubah perilaku molekul, dan fragmen itu kekal dalam setiap reka bentuk semula yang berikutnya. Kekalkan kumpulan itu dan gantikan cincin fenotiazinium dengan akridina, maka hasilnya ialah kuinakrina. Gantikan dengan kuinolina, maka hasilnya ialah klorokuin. Pamakuin, primakuin dan amodiakuin, yang semuanya masih tersenarai sebagai antimalaria, mempunyai kumpulan yang sama. Sebatian yang gagal sebagai rawatan membekalkan bahagian yang berjaya.

Hubungan dengan antipsikotik terjalin melalui cincin, bukannya melalui ubat tersebut. Penjelasan struktur biru metilena membawa Heinrich August Bernthsen kepada nukleus induk fenotiazina pada 1883. Kerangka itu, dengan penggantian yang berbeza-beza, menjadi tumpuan ahli kimia di Rhône-Poulenc pada tahun-tahun 1940-an ketika mencari antihistamin. Salah satu sebatian itu disintesis sekitar penghujung 1950 dan diuji oleh pakar bedah Henri Laborit, yang mendapati bahawa pesakit menjadi tenang dan tidak peduli. Penggunaan psikiatrinya yang pertama diterbitkan, pada seorang pesakit dengan mania, muncul pada Januari 1952. Antipsikotik pertama itu lebih merupakan saudara jauh kepada pewarna yang menjadi titik mula Ehrlich, bukannya keturunan langsung antimalarianya.

Tiga amalan daripada episod ini yang wajar dikekalkan

1. "Ubat sintetik pertama yang digunakan dalam perubatan" menerangkan suatu kategori, dan syarat yang menyertainya lebih luas daripada yang dibayangkan oleh ungkapan itu. Ungkapan itu sudah menjadi sebutan lazim; sebuah ulasan yang banyak dipetik oleh Schirmer dan rakan-rakan dalam Neurobiology of Aging menyebut biru metilena sebagai ubat sintetik sepenuhnya yang paling awal digunakan dalam perubatan. Kloral hidrat diperkenalkan sebagai sedatif sintetik pada 1869, lebih daripada dua puluh tahun sebelumnya. Makalah 1891 itu sendiri memberikan sebahagian jawapannya, kerana penulisnya menamakan antipiretik sintetik yang telah pun gagal melawan malaria, antaranya kuinolina, antipirina dan antifebrin. Sebatian arsenik Ehrlich sendiri untuk sifilis muncul lebih lewat lagi. Versi dakwaan yang dapat dipertahankan berkaitan dengan kaedah, bukannya siapa yang mendahului: biru metilena ialah antara sebatian sintetik terawal yang dipilih untuk bertindak terhadap organisma tertentu berdasarkan teori kimia tentang keselektifan.
2. Taburan selektif tidak bermakna manfaat selektif. Hasil Ehrlich pada 1886 ialah pewarna itu menuju ke tisu saraf. Ke mana sesuatu sebatian pergi dan apa yang dilakukannya apabila tiba ialah dua pengukuran yang berbeza, dan yang pertama jauh lebih mudah dibuat. Sejak itu, kebanyakan dakwaan tentang biru metilena dan otak bertumpu pada jurang tersebut.
3. Ketulenan ialah sebahagian daripada bukti, bukan pemasaran. Rekod sejarah kabur tepat kerana sebab ini. Perbezaan struktur yang kecil mengubah destinasi sebatian ini. Oleh itu, sijil analisis mesti dikaitkan dengan lot tertentu, bukannya dikemukakan sebagai pernyataan umum bahawa sesuatu produk telah diuji. Penjual yang mendakwa pematuhan kepada monograf farmakope tetapi hanya menguji logam berat membuat dakwaan yang melampaui sokongan laporan tersebut. Blupreme mendapatkan biru metilena daripada pengilang farmaseutikal dan menguji spesifikasi penuh yang ditetapkan oleh monograf: identiti, ketulenan, bendasing organik, pelarut baki, bendasing unsur, sisa pemijaran, had mikrob dan endotoksin bakteria. Laporan itu diterbitkan bersama produk, dan halaman biru metilena gred USP menerangkan had tersebut serta sebab keputusan azure B patut diperiksa terlebih dahulu.

Jejak sumber mengikut tarikh

Urutan peristiwa penting mengikut tarikh, termasuk kimia pewarna yang mendahului Ehrlich serta gred dan spesifikasi yang muncul selepasnya, dihuraikan secara berasingan dalam sejarah biru metilena, manakala identiti sebatian itu sendiri dibincangkan dalam apakah biru metilena.

Plat ilustrasi yang mendasari huraian ini, yang diterbitkan semula dalam ulasan 2012 oleh Krafts, Hempelmann dan Skórska-Stania, tidak setara, dan satu contoh menunjukkan sebabnya. Plat 1891 ialah rekod primer ujian itu; potret 1910 di sebelahnya hanya menandakan reputasi pada tarikh tersebut, tidak lebih daripada itu. Halaman daripada buku nota Andersag pada 1934 ialah jejak langsung penggantian kuinolina, dalam tulisan tangan ahli kimia itu sendiri.

Rumusan jujur tentang eksperimen pewarna Ehrlich ialah beliau betul tentang keselektifan dan sasaran, tetapi tersilap tentang mekanismenya. Biru metilena memang tertumpu dalam tisu saraf dan memang memudaratkan parasit malaria. Kesan kedua itu bukan berlaku kerana sifat pertama, dan penjelasan kimia yang diberikannya untuk kedua-duanya adalah salah. Apa yang dibuktikannya tanpa keraguan lebih berkekalan daripada mekanisme yang betul: sesuatu sebatian boleh dipilih, bukannya sekadar ditemui, dan dipilih berdasarkan bukti yang dikumpulkan sebelum sesiapa memberikannya kepada pesakit.