Ferroptosis dan metilena biru: mekanisme peroksidasi lipid

Ferroptosis ialah kematian sel akibat kerosakan membran. Lemak politaktepu dalam membran teroksida melalui tindak balas berantai, membran gagal berfungsi, lalu sel mati. Besi diperlukan untuk proses kimia ini. Ayat itu merangkumi keseluruhan konsep tersebut, dan segala yang dibincangkan dalam artikel ini menguji salah satu bahagiannya.

Persoalan di sini lebih khusus: apakah kesan metilena biru terhadap rantaian itu dalam eksperimen sel, dan apakah yang sebenarnya ditunjukkan oleh hasil tersebut. Jawapan ringkasnya ialah, dalam dua kajian makmal, metilena biru pada kepekatan nanomolar mengurangkan peroksidasi lipid mitokondria dan memastikan sel terus hidup selepas dikenakan pencetus yang biasanya menyebabkan ferroptosis. Jawapan yang lebih terperinci lebih penting, kerana setiap pautan dalam rantaian itu diuji dengan intervensi yang berbeza, dan setiap intervensi mempunyai batasan.

Ferroptosis dalam satu perenggan

Fosfolipid membran yang mempunyai ekor asid lemak politaktepu mempunyai titik lemah: atom hidrogen yang mudah dirampas. Sebaik sahaja satu atom itu dirampas oleh radikal, oksigen bergabung dengan lipid tersebut, radikal peroksil lipid terbentuk, dan radikal itu merampas atom hidrogen daripada lipid seterusnya. Tindak balas ini merebak sepanjang membran melainkan sesuatu menghentikannya.

Isyarat penghenti utama ialah enzim yang dipanggil GPX4, yang menggunakan glutation untuk menurunkan peroksida lipid kepada alkohol lipid yang tidak berbahaya. Pencetus makmal menyerang pertahanan ini pada titik tertentu. Erastin menyekat kemasukan sistina melalui sistem xc-minus, menyebabkan sel kekurangan sisteina untuk sintesis glutation. Buthionine sulfoximine menyekat sintesis glutation secara langsung. RSL3 merencat GPX4 itu sendiri. Ketiga-tiganya menyebabkan peroksida tidak disingkirkan, tetapi bertindak pada langkah yang berbeza, jadi hasil daripada satu pencetus tidak boleh digeneralisasikan secara automatik kepada pencetus lain.

Ferroptosis berbeza daripada apoptosis dari segi ciri yang mentakrifkannya. Tiada lata kaspase dan tiada jasad apoptotik. Pengkelat besi seperti deferoxamine dan agen pemerangkap radikal seperti ferrostatin-1 menyekatnya, dan inilah ujian operasi yang digunakan penyelidik untuk mengelaskan sesuatu kematian sebagai ferroptosis, bukan sekadar nekrosis. Gambaran lebih luas tentang laluan kematian sel terkawal memberikan konteks kepada perbezaan ini, manakala cara sel mengendalikan besi labil menjelaskan mengapa pengkelatan merupakan kawalan yang begitu menentukan.

Peranan mitokondria dan sebab ia dipertikaikan

Kajian awal melaporkan bahawa sel tanpa DNA mitokondria masih mengalami ferroptosis, yang menunjukkan bahawa mitokondria tidak semestinya diperlukan. Kajian kemudian mendapati bahawa pengurangan mitokondria, atau penyekatan respirasi, boleh menyekat ferroptosis akibat kekurangan sisteina tetapi bukan akibat perencatan GPX4 secara langsung. Kedua-dua hasil ini boleh benar jika sumbangan mitokondria bergantung pada pencetus, jenis sel, dan lokasi berlakunya peroksidasi yang menentukan kematian sel.

Kajian yang menjadi asas artikel ini menangani pertikaian tersebut menggunakan prob khusus kompartmen. MitoCLox ialah versi penunjuk peroksidasi lipid yang disasarkan kepada mitokondria: pendarfluornya berubah apabila ia bertemu radikal peroksil lipid di dalam mitokondria. Dalam fibroblas yang dirawat dengan erastin, pengoksidaan prob mitokondria muncul dalam sel yang masih hidup sebelum kematian, dan tahapnya berbeza-beza dalam populasi sel. Urutan masa itu penting. Peroksidasi yang mendahului kematian berpotensi menjadi puncanya. Peroksidasi yang diukur hanya dalam sel mati ialah sisa kerosakan. Panduan iringan tentang asai peroksidasi lipid dan perkara yang dilaporkan oleh setiap prob menerangkan mengapa lokasi prob menentukan makna sesuatu isyarat.

Corak yang sama muncul dalam model kedua. Fibroblas daripada seorang pesakit neuropati optik keturunan Leber, yang membawa mutasi kompleks I dan mempunyai tekanan oksidatif asas yang lebih tinggi, mati melalui ferroptosis apabila glutation dikurangkan, manakala fibroblas kawalan tidak terjejas. Sekali lagi, pengoksidaan prob mitokondria berlaku terlebih dahulu. Butirannya terdapat dalam kajian fibroblas tentang peroksidasi lipid mitokondria dalam ferroptosis.

Perubahan yang disebabkan oleh metilena biru dalam eksperimen ini

Metilena biru ialah pembawa redoks. Bentuk teroksidanya menerima elektron daripada proses kimia berkaitan NADH pada kompleks I, dan bentuk tereduksinya mendermakan elektron itu kepada sitokrom c, yang menyalurkannya kepada kompleks IV. Ini mewujudkan pintasan separa pada bahagian rantaian tempat elektron biasanya bocor kepada oksigen sebagai superoksida. Pembaca yang mahukan gambaran penuh pemindahan ini boleh bermula dengan cara metilena biru memindahkan elektron melalui mitokondria.

Dalam fibroblas paru-paru yang dirawat dengan erastin, metilena biru pada 250 nanomolar mengekalkan viabiliti berdasarkan bacaan kelangsungan hidup sel, bersama-sama antioksidan yang disasarkan kepada mitokondria, SkQ1 dan MitoTEMPO. Kawalan yang digunakan menentukan skop dakwaan ini. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol, dan deferoxamine juga memberikan perlindungan, yang mengesahkan bahawa kematian itu berlaku melalui ferroptosis. Analog SkQ1 tanpa kumpulan antioksidan tidak memberikan perlindungan, yang menunjukkan peranan proses kimia redoks dan bukannya pengumpulan tidak khusus. Perlindungan berkurang pada kepekatan SkQ1 melebihi kira-kira 200 nanomolar, selaras dengan sifat prooksidan antioksidan kuinon yang diketahui pada aras lebih tinggi. Metilena biru mempunyai kesan bergantung pada dos yang sama: melindungi pada aras nanomolar rendah dalam piring kultur ini, tetapi mampu menghasilkan hidrogen peroksida melalui kitaran redoks apabila arasnya dinaikkan atau apabila terdedah kepada cahaya kuat. Konteks dos seperti ini dibincangkan dalam spesies oksigen reaktif dalam mitokondria.

Eksperimen menggunakan mitokondria terasing kemudian membezakan sumber ROS. Dengan adanya besi ferus, substrat yang membekalkan elektron kepada kompleks I bersama rotenone merangsang pengoksidaan prob. Rotenone menyekat aliran di hilir tapak flavin, jadi pembawa di hulu kekal dalam keadaan tereduksi dan membocorkan elektron kepada oksigen daripada flavin yang menghadap matriks. Substrat yang membekalkan elektron kepada kompleks III bersama antimycin A menghasilkan hidrogen peroksida yang banyak tetapi tidak mencetuskan peroksidasi lipid. Isyarat ROS keseluruhan yang sama, lokasi berbeza, hasil berbeza. SkQ1 dan metilena biru masing-masing menyekat peroksidasi yang dicetuskan oleh kompleks I tanpa menyekat penghasilan hidrogen peroksida itu sendiri, yang menempatkan tindakan kedua-duanya selepas pembentukan ROS, pada langkah peroksidasi lipid.

Bahagian kajian lebihan besi dan petunjuk lipofusin

Kajian kedua meneliti persoalan ini dari sudut besi. Kardiomiosit H9c2 yang didedahkan kepada ferik ammonium sitrat pada kepekatan submilimolar menghasilkan ROS mitokondria, mengalami peroksidasi lipid mitokondria, kemudian ferroptosis, diikuti pengumpulan pigmen seakan-akan lipofusin dalam masa 24 jam. Lipofusin ialah sisa lipid dan protein teroksida yang mengandungi besi serta berautopendarfluor, yang terkumpul seiring pertambahan usia. Kemunculannya yang pantas di sini menghubungkan peroksidasi akut yang dicetuskan oleh besi dengan penanda penuaan klasik. Metilena biru pada kepekatan nanomolar dan SkQ1 masing-masing menghalang peroksidasi, kematian, dan pengumpulan pigmen tersebut. Mitokondria jantung terasing mengesahkan corak ini: rotenone bersama besi ferus mencetuskan peroksidasi dan isyarat seakan-akan pigmen, dan kedua-dua agen menyekatnya. Urutan penuh ini dilaporkan dalam kajian lebihan besi dalam kardiomiosit H9c2. Aspek pigmen ini berkaitan dengan lipofusin dan penanda penuaan sel.

Perkara yang tidak ditunjukkan oleh asai kelangsungan hidup sel

Bacaan viabiliti seperti CellTiterBlue melaporkan bilangan sel dalam piring kultur yang kekal aktif secara metabolik selepas dikenakan pencetus bersama calon agen pelindung. Itu ialah ujian mekanisme dalam sistem yang ditetapkan. Ia bukan hasil rawatan. Tiada satu pun eksperimen ini memberikan dos kepada pesakit, mengukur titik akhir penyakit, atau menetapkan julat terapeutik dalam tubuh.

Empat batasan perlu dinyatakan dengan jelas. Pertama, jenis selnya terhad: fibroblas paru-paru yang telah mengalami transformasi, fibroblas kulit primer termasuk satu galur penyakit mitokondria, dan satu galur kardiomiosit tikus, serta mitokondria jantung tikus terasing. Kepekaan berbeza mengikut galur, dan galur LHON memang dipilih kerana kerentanannya yang luar biasa. Kedua, pencetusnya ialah keadaan ekstrem makmal: penyekatan pengangkutan atau sintesis sepenuhnya, serta beban besi yang tidak akan dialami oleh mana-mana tisu secara akut. Ketiga, kepekatan tidak boleh diterjemahkan kepada dos hanya melalui pendaraban. Kepekatan nanomolar dalam medium kultur bukanlah dos manusia, dan pengagihan metilena biru, penurunannya kepada bentuk tanpa warna dalam darah dan tisu, pendedahan cahaya, serta keupayaan membran semuanya mempengaruhi perbezaan antara piring kultur dengan manusia. Keempat, prob melaporkan keadaan dalam kompartmennya sendiri. Pengoksidaan MitoCLox menunjukkan bahawa radikal lipid mitokondria telah terbentuk; ia tidak menunjukkan bahawa pecahnya membran plasma, yang berkemungkinan merupakan peristiwa akhir, dicegah secara langsung dan bukannya dielakkan melalui tindakan di hulu.

Jadi, dakwaan yang jujur ialah: dalam model ini, ROS yang berasal daripada kompleks I bersama besi mencetuskan peroksidasi lipid mitokondria yang mendahului ferroptosis, dan metilena biru pada kepekatan rendah mengganggu bahagian rantaian tersebut. Sebarang dakwaan di luar bahagian itu memerlukan eksperimen yang berbeza pada haiwan, kemudian pada manusia.