Biru metilena dan sklerosis berbilang: perkara yang diuji dalam penyelidikan haiwan

Cari biru metilena untuk MS dan anda akan menemui makalah yang seolah-olah menjawab soalan yang sama. Sebenarnya tidak. Satu makalah memberikan biru metilena kepada mencit yang sakit sebagai rawatan. Satu lagi tidak pernah menggunakannya untuk merawat mana-mana haiwan. Makalah itu menggunakan biru metilena sebagai pewarna biru pada hirisan nipis saraf tunjang supaya ahli patologi dapat melihat mielin di bawah mikroskop.

Inilah konsep yang mendasari keseluruhan artikel ini. Pewarna tersebut mempunyai dua peranan dalam biologi yang tiada persamaan selain berasal daripada botol yang sama. Sebagai calon ubat, ia diberikan pada dos tertentu kepada haiwan hidup, dan persoalannya ialah sama ada penyakit berubah. Sebagai pewarna, ia digunakan pada tisu mati yang telah difiksasi selepas eksperimen, dan persoalannya ialah bagaimana rupa tisu itu. Jika anda terlepas perbezaan ini, anda akan membaca bahagian kaedah patologi seolah-olah ia merupakan hasil rawatan.

Apakah EAE, dalam bahasa mudah

Ensefalomielitis autoimun eksperimen, yang biasanya disingkatkan sebagai EAE, ialah model haiwan standard untuk aspek tertentu sklerosis berbilang. Penyelidik mengimunkan mencit yang rentan dengan fragmen protein mielin bersama adjuvan yang kuat. Sistem imun kemudian menyerang sistem saraf pusat haiwan itu sendiri. Mencit tersebut mengalami kelemahan menaik yang mudah dinilai pada skala 0 hingga 5, daripada ekor yang terkulai hingga kelumpuhan anggota belakang.

Kemudahan pemarkahan itu menjelaskan mengapa EAE popular, dan juga mengapa ia boleh mengelirukan. MS pada manusia timbul dengan sendirinya, melibatkan sasaran yang lebih luas dan kurang jelas, serta menghasilkan gejala optik, deria, kognitif, serebelum dan motor dalam perjalanan penyakit yang berulang atau progresif. EAE menghasilkan semula mekanisme terpilih seperti keradangan, penyahmielinan dan kecederaan akson dalam keadaan terkawal. Ia bukan versi mini MS. Pembaca yang mahukan kerangka umum boleh meneliti bagaimana biru metilena dianggap bertindak pada peringkat sel sebelum menilai sebarang dakwaan khusus tentang penyakit.

Dua makalah di bawah juga menggunakan antigen EAE yang berbeza, dan perbezaan itu penting. Kajian rawatan mencetuskan penyakit menggunakan MOG35-55, peptida pendek daripada glikoprotein oligodendrosit mielin. Kajian patologi mencetuskan penyakit menggunakan MP4, gabungan segmen protein asas mielin dan protein proteolipid. Pilihan strain dan antigen mengubah lokasi lesi serta tingkah laku keradangan, maka kedua-dua kajian itu bukan dua ulangan eksperimen yang sama.

Peta: daripada model kepada persoalan dan batas

Pastikan jadual ini kekal terbuka. Ia merupakan rujukan asal bagi artikel ini. Setiap baris menyatakan persoalan klinikal yang boleh ditangani oleh model tersebut, perkara yang sebenarnya diukur, dan batas penerapan hasilnya kepada manusia.

Sesiapa yang menyemak tajuk berita seterusnya boleh menggunakan semula lajur yang sama dengan bantuan cara membaca kajian praklinikal: tanyakan spesies dan antigen yang digunakan, peranan sebatian, titik akhir, dan sama ada hasilnya menggambarkan perjalanan penyakit atau keadaan tisu pada satu-satu masa.

Hasil rawatan: perubahan akibat pemberian dos

Kajian rawatan 2016 dalam Journal of Neuroimmunology menggunakan mencit C57BL/6 betina, berumur kira-kira 8 hingga 10 minggu, yang diimunkan dengan 250 mikrogram MOG35-55 bagi setiap mencit. Selepas pencetusan penyakit, haiwan EAE diagihkan secara rawak kepada kumpulan biru metilena atau kumpulan EAE tanpa rawatan, dan skor klinikal dipantau sehingga kira-kira hari 30.

Skor klinikal mencit yang dirawat adalah lebih rendah secara signifikan berbanding kumpulan kawalan EAE dari hari 15 hingga hari 30, dengan P kurang daripada 0.01. Analisis saraf tunjang menunjukkan arah yang sama, dengan kurang infiltrasi keradangan, kurang penyahmielinan dan kurang kehilangan akson pada haiwan yang dirawat.

Bahagian yang tersendiri ialah panel pengisyaratan. Rawatan meningkatkan pengaktifan AMPK dan ekspresi SIRT1 serta menekan pengaktifan NF-kB, suis utama keradangan. Dari segi imun adaptif, rawatan mengurangkan respons Th17 dan menguatkan respons Treg. Oleh itu, rantaian yang dicadangkan ialah biru metilena kepada AMPK dan SIRT1, kemudian kepada pengisyaratan NF-kB yang lebih rendah, diikuti peralihan daripada Th17 yang bersifat keradangan ke arah Treg yang bersifat pengawalseliaan, seterusnya kecederaan tisu yang lebih ringan dan skor yang lebih rendah.

Rantaian itu ialah tafsiran, bukan urutan sebab-akibat yang telah dibuktikan. Kajian tersebut menunjukkan bahawa ubat, perubahan isyarat dan pengurangan keterukan penyakit berlaku seiring. Ia tidak membuktikan bahawa AMPK dan SIRT1 menyumbang keseluruhan manfaat tersebut, dan teks yang diindeks secara terbuka tidak menyatakan dos tepat dalam miligram per kilogram, laluan pemberian, hari permulaan atau tempoh dengan cukup jelas untuk menghasilkan semula rejimen berdasarkan abstrak sahaja. Anggap sebarang angka dos tentang makalah ini yang dipetik pada halaman jualan sebagai belum disahkan melainkan ia merujuk kaedah dalam teks penuh. Bukti manusia yang lebih luas tentang biru metilena ialah sumber untuk menyemak sama ada isyarat imun awal ini akhirnya berkembang menjadi data klinikal.

Hasil patologi: perkara yang ditunjukkan oleh tisu sepanjang enam bulan

Kajian MP4 2015 dalam PLoS ONE menggunakan mencit C57BL/6 betina yang diimunkan dengan 200 mikrogram MP4 dalam adjuvan lengkap Freund bersama toksin pertusis pada hari pengimunan dan sekali lagi 48 jam kemudian. Tiada haiwan menerima biru metilena sebagai ubat. Selepas fiksasi dan pembenaman, keratan melintang saraf tunjang setebal satu mikrometer diwarnakan dengan biru metilena untuk mikroskopi cahaya, manakala mikroskopi elektron pada traktus ventrolateral digunakan untuk melihat butiran yang lebih halus.

Tisu disampel pada tiga peringkat: kemuncak akut dengan 7 mencit, tiga bulan selepas bermulanya penyakit dengan 5 mencit, dan enam bulan selepas bermulanya penyakit dengan 10 mencit. Purata skor klinikal pada peringkat tersebut kelihatan hampir sama, sekitar 1.7 hingga 1.8 pada skala 0 hingga 5. Tisu menunjukkan gambaran yang berbeza. Kerosakan mielin sahaja meningkat daripada kira-kira 569,000 serabut per milimeter persegi pada kemuncak akut kepada kira-kira 1,496,000 pada enam bulan, dengan perbandingan antara peringkat akut dan jangka panjang signifikan pada P bersamaan 0.027. Kerosakan gabungan mielin dan akson meningkat kira-kira dua kali ganda menjelang enam bulan. Serabut yang mengalami pemielinan semula kekal di bawah satu peratus pada setiap peringkat, suatu butiran yang meredakan harapan terhadap pemulihan.

Kecederaan akson mengikuti corak berbentuk U: tinggi pada kemuncak akut, lebih rendah pada tiga bulan dan tertinggi pada enam bulan, serta berkorelasi dengan pembengkakan mitokondria dan pengurangan jarak antara neurofilamen. Penilaian dilakukan tanpa mengetahui skor dan peringkat, yang mengukuhkan tafsiran bahawa skor klinikal tidak mencerminkan sepenuhnya kerosakan struktur yang berterusan.

Ketidakpadanan itu merupakan sumbangan sebenar kajian ini kepada pembaca yang meneliti MS. Skor ketidakupayaan yang stabil tidak bermakna tisu juga stabil. Hal ini turut menunjukkan mengapa makalah ini tidak boleh menyokong sebarang dakwaan tentang biru metilena sebagai rawatan MS. Ia menguji masa, bukan rawatan.

Mengapa kedua-dua kajian tidak membuktikan manfaat kepada pesakit

Anggap setiap makalah sebagai menjawab satu persoalan sempit dengan baik, tetapi langsung tidak menjawab persoalan tentang pesakit.

Pertama, puncanya berbeza. EAE dicetuskan dengan sengaja menggunakan antigen dan adjuvan tertentu. MS pada manusia berkembang secara spontan dengan rangkaian imun yang lebih luas, termasuk sel T, sel B, imuniti semula jadi dan glia residen. Sebatian yang mengubah respons yang cenderung kepada MOG pada mencit tidak semestinya mengubah respons manusia yang lebih luas itu.

Kedua, fenotipnya berbeza. Kelemahan menaik daripada ekor ke anggota belakang pada mencit ialah ukuran yang mudah digunakan. Ia memampatkan kepelbagaian MS manusia menjadi satu angka motor. Ubat kerap mengubah skor EAE jangka pendek tanpa mengubah perjalanan penyakit manusia, sebab itulah EAE merupakan alat saringan dan kajian mekanisme, bukannya klinik dalam bentuk mini.

Ketiga, pendedahan dan masa pemberian masih belum terjawab. Pemberian dos secara berterusan yang dimulakan awal dalam eksperimen mencit selama 30 hari tidak sama dengan penggunaan oral kronik oleh seseorang yang sudah menghidap penyakit, dan kedua-dua kajian tidak mengukur paras ubat dalam sistem saraf. Tanpa hubungan itu, tiada asas untuk menghubungkan kepekatan pada plat atau dos pada mencit dengan rejimen manusia.

Keempat, kedua-dua makalah itu tidak mengulangi hasil satu sama lain. Antigen berbeza, persoalan berbeza, titik akhir berbeza, dan dalam satu kajian, tiada rawatan langsung. Memetik kedua-duanya sebagai dua kajian rawatan MS yang positif ialah kesilapan pengelasan.

Maknanya bagi pembaca yang menimbang bukti

Makalah-makalah ini tidak menetapkan sebarang protokol biru metilena untuk MS. Kajian rawatan menyokong penyelidikan lanjut tentang AMPK, SIRT1, NF-kB dan keseimbangan Th17 dengan Treg dalam MOG EAE. Kajian patologi mengingatkan bahawa kecederaan tisu boleh terus berkembang walaupun skor kelihatan tidak berubah, dan bahawa biru metilena dalam bahagian kaedah kadangkala merujuk kepada bekas pewarna, bukannya ubat. Pembaca yang mengikuti penyelidikan sklerosis berbilang yang sedang berlangsung perlu mengingati perbezaan antara pewarna dan ubat itu. Persoalan keselamatan, termasuk risiko berkaitan darah dan interaksi, perlu dibincangkan dengan doktor bersama data keselamatan umum biru metilena sebelum sesiapa bertindak berdasarkan tajuk berita makmal.

Kesimpulannya boleh dirangkum dalam satu ayat. Satu kajian yang dirujuk memberikan dos biru metilena kepada mencit MOG EAE dan melaporkan penyakit yang lebih ringan dengan perubahan imun yang bersifat antiradang, manakala kajian lain yang dirujuk tidak memberikan sebarang dos dan menggunakan biru metilena hanya untuk mewarnakan saraf tunjang sambil mendokumentasikan kerosakan mielin dan akson yang terkumpul selama enam bulan, maka kedua-duanya tidak membuktikan bahawa biru metilena membantu MS pada manusia.