Bolehkah biru metilena memintas Kompleks III mitokondria? Mengapa kajian tidak sependapat

Dua makmal mengkaji sama ada biru metilena boleh memintas Kompleks III mitokondria yang disekat. Satu menjawab tidak. Satu lagi menjawab ya. Kedua-duanya mempunyai data.

Kajian pertama, pada mitokondria otak mencit, mendapati pewarna itu tidak boleh melakukannya. Kajian kedua, pada mitokondria otak daripada tiga spesies rodensia, mendapati ia boleh melakukannya sebahagian. Kajian ketiga, pada hati mencit, sering dipetik bersama kajian-kajian ini tetapi menguji perkara lain. Letakkannya dalam konteks yang betul dan separuh daripada kekeliruan itu akan terurai.

Tiada mekanisme sejagat yang boleh diumumkan. Terdapat tiga eksperimen dengan penyekat, dos dan bacaan yang berbeza. Baca keadaan eksperimen dahulu. Kesimpulannya menyusul.

Maksud pintasan di sini

Elektron memasuki rantai melalui Kompleks I (daripada NADH) atau Kompleks II (daripada suksinat), melalui Kompleks III ke sitokrom c, kemudian melalui Kompleks IV ke oksigen. Gradien yang terbentuk sepanjang laluan itu digunakan oleh sel untuk menghasilkan ATP.

Dakwaan pintasan menyatakan bahawa biru metilena mengambil elektron di hulu sekatan dan menyerahkannya di hilir. Pewarna teroksida menerima elektron daripada NADH atau komponen awal rantai, lalu menjadi leukometilena biru, dan bentuk terturun itu menyerahkannya kepada sitokrom c atau kembali ke dalam rantai. Jika pemindahan itu berlaku di hilir sekatan, respirasi dan keupayaan membran pulih sebahagian. Jika ia berlaku pada sekatan atau di hulunya, tiada pemulihan berlaku.

Satu butiran tentang Kompleks III banyak menentukan pertikaian ini. Kompleks itu menjalankan kitaran Q dengan dua tapak perencat. Antimisin mengikat tapak Qi. Miksotiazol mengikat tapak Qo. Kajian yang menggunakan hanya satu daripadanya telah menguji hanya separuh daripada kompleks itu.

Kajian pertama: tiada pintasan dalam mitokondria otak mencit

Gureev dan rakan-rakan menggunakan mitokondria korteks daripada mencit C57BL/6, yang diasingkan menggunakan digitonin dan diuji pada 0.1 mg protein per ml. Substrat merangkumi tiga keadaan: piruvat bersama malat pada 5 mM setiap satu, suksinat pada 10 mM bersama glutamat pada 2 mM, dan L-prolina pada 10 mM. Penyekat yang digunakan ialah rotenon pada 1 micromolar (Kompleks I) dan antimisin pada 1 microgram per ml (Kompleks III). Dos pewarna ialah 0.5, 1 dan 2 micromolar, dengan 1 micromolar sebagai kepekatan utama. Kaedah dan surihan bacaan terdapat dalam komunikasi FEBS Letters.

Pintasan Kompleks I berjaya. Rotenon mengurangkan respirasi yang dirangsang ADP daripada kira-kira 121 kepada kira-kira 2 nmol per minit per mg, dan pewarna pada 1 micromolar memulihkannya kepada kira-kira 21. Keupayaan membran pulih dengan piruvat bersama malat dan dengan L-prolina.

Pintasan Kompleks III tidak berjaya. Antimisin mengurangkan respirasi kepada kira-kira 16, dan pewarna hanya menaikkannya kepada kira-kira 20. Keupayaan membran tidak pulih dengan mana-mana substrat, pada dos pewarna sehingga 5 micromolar. Data peroksida menunjukkan arah yang sama: pewarna sahaja meningkatkan pelepasan peroksida daripada kadar asas hampir 76 pmol per minit per mg kepada kira-kira 1170, 1460 dan 1945 pada ketiga-tiga dos, tetapi antimisin mengurangkan isyarat yang didorong pewarna itu masing-masing sebanyak kira-kira 25, 88 dan 96 peratus. Jika pewarna terturun bertindak balas secara langsung dengan oksigen, penyekatan Kompleks III sepatutnya tidak menekan isyarat itu. Penulis membuat inferens bahawa pewarna terturun dioksidakan pada tapak Qo Kompleks III, di hulu sekatan antimisin. Gelung pendek itu, dalam kata-kata: penderma ke pewarna, pewarna ke Qo, kemudian terus melalui laluan biasa. Rotenon dipintas. Antimisin tidak.

Kajian kedua: pintasan separa dalam tiga spesies, pada kedua-dua tapak perencat

Svab dan rakan-rakan memperluas reka bentuk kajian. Mitokondria otak daripada mencit, tikus dan tikus belanda, yang diasingkan menggunakan Percoll, diuji pada kepekatan yang sama, 0.1 mg per ml, dengan piruvat bersama malat atau glutamat bersama malat pada 5 mM setiap satu. Mereka menggunakan dua penyekat Kompleks III: antimisin A pada 0.3 micromolar dan miksotiazol pada 1 micromolar. Pewarna digunakan pada 2 micromolar dalam kebanyakan ujian, dan 0.5 dalam ujian sitokrom c. Ketiga-tiga spesies dengan protokol yang sepadan dibincangkan dalam makalah akses terbuka.

Kedua-dua sekatan dipintas sebahagian, dalam ketiga-tiga spesies. Dalam mitokondria mencit, antimisin menekan respirasi dan pewarna meningkatkannya kira-kira 60 peratus, daripada sekitar 37 kepada 59 nmol per minit per mg. Miksotiazol menekannya sebanyak 88 peratus, kepada kira-kira 4.5, dan pewarna meningkatkannya lima kali ganda kepada kira-kira 23. Keupayaan membran mengalami repolarisasi separa dengan mana-mana perencat, diukur menggunakan dua pewarna (safranin O dan TMRM rasiometrik) untuk menyingkirkan kemungkinan artifak optik.

Makalah ini juga menguji pemindahan elektron secara langsung, sesuatu yang tidak pernah dilakukan dalam kajian pertama. Sitokrom c terasetil eksogen pada 25 micromolar tidak diturunkan oleh mitokondria bertenaga, sama ada dengan atau tanpa perencat, tetapi penambahan pewarna mendorong penurunan dalam kedua-dua keadaan. Dalam larutan penimbal tanpa sel, NADH bersama pewarna menurunkan sitokrom c pada kadar yang berkadar terus dengan NADH. Lompatan yang lebih jauh itu, dalam kata-kata: setara penurunan ke pewarna, pewarna terus ke sitokrom c, Kompleks IV ke oksigen. Laluan itu melangkaui Kompleks III sepenuhnya, jadi kedua-dua penyekat boleh dipintas.

Dua bacaan tambahan menyokong tafsiran itu. Pendarfluor NAD(P)H menurun apabila pewarna ditambahkan kepada mitokondria yang dirawat dengan miksotiazol, menandakan setara penurunan mengalir keluar melalui laluan baharu. Selain itu, penyerapan cahaya oleh pewarna pada 660 nm menjejaki setiap penambahan secara berturutan, manakala supernatan selepas pengemparan menunjukkan pengumpulan pewarna teroksida di dalam mitokondria bertenaga melebihi seratus kali ganda, sebelum keluar apabila keupayaan membran runtuh. Imbangan proton juga sepadan: melangkaui langkah pengepaman meninggalkan kira-kira 2 proton bagi setiap pasangan elektron dan bukannya 10, jadi penggunaan oksigen yang lebih pantas dengan repolarisasi separa sahaja ialah gambaran pintasan sebenar, bukan bukti yang menentangnya.

Sediaan yang sama menghasilkan respons yang mudah disalah tafsir jika dibaca sepintas lalu. Dengan perencat bersama pewarna, ADP menurunkan respirasi dan bukannya meningkatkannya, dan sekatan pengangkutan merangsangnya dan bukannya memperlahankannya, sedangkan keupayaan membran masih berubah dalam arah yang biasa. Penggunaan oksigen sahaja boleh mengelirukan dalam sistem ini.

Kajian ketiga: kajian hati yang menguji Kompleks I dan II, bukan III

Lee dan Boelsterli menggunakan mitokondria hati mencit dan hepatosit kultur yang mengalami kerosakan akibat efavirenz (Kompleks I, IC50 hampir 30 micromolar) dan hidrazina, metabolit isoniazid (Kompleks II, IC50 hampir 30 micromolar). Pewarna pada kira-kira 30 micromolar memulihkan pengoksidaan NADH, keupayaan membran dan ATP sambil mengurangkan oksidan dan kematian nekrotik. Makalah Redox Biology memodelkannya sebagai pewarna yang membawa elektron memintas Kompleks I dan II yang rosak.

Dapatan itu memberikan konteks hulu yang disepakati, dan tidak memberikan maklumat tentang Kompleks III kerana tiada sekatan dikenakan di situ. Ia tidak boleh mengesahkan atau menyangkal mana-mana kajian otak tersebut.

Matriks keadaan eksperimen

Empat sebab kedua-dua kajian Kompleks III boleh betul dalam keadaan eksperimen masing-masing

1. Penyekat itu bukan intervensi yang sama. Antimisin sahaja pada 1 microgram per ml berbanding antimisin pada 0.3 micromolar bersama penyekat tapak Qo yang berasingan. Laluan pewarna yang menyalurkan elektron ke tapak Qo gagal tepat di tempat laluan terus ke sitokrom c berjaya. Satu tapak tidak boleh mewakili kedua-duanya.

2. Dos pewarna dan masa berbeza. Kepekatan utama 1 berbanding 2 micromolar, bagi bahan yang berkitar redoks dan yang pengambilannya serta penurunan langsung sitokrom c bergantung pada kepekatan dan masa. Perbezaan dos yang kecil bersama masa pengukuran yang berbeza boleh mendedahkan cabang berlainan dalam rangkaian yang sama.

3. Sediaan berbeza. Pengasingan menggunakan digitonin berbanding pengasingan melalui gradien Percoll memilih populasi mitokondria yang bertindih tetapi tidak sama sepenuhnya. Kepekatan protein sepadan pada 0.1 mg per ml, jadi pemboleh ubah itu boleh diketepikan, tetapi subpopulasi dan integriti tidak. Spesies juga diketepikan sebagai punca yang disyaki: kumpulan kedua menghasilkan semula fenotipnya dalam mencit juga.

4. Keadaan substrat menentukan apa yang boleh dilakukan oleh pewarna. Tiga keadaan substrat berbanding pasangan yang berkaitan dengan NADH. Bekalan NADH dan keupayaan membran bersama-sama menentukan seberapa cepat pewarna diturunkan dan bagaimana ia teragih, dan laluan yang memerlukan pewarna terturun berdekatan sitokrom c teroksida bergantung pada pilihan itu.

Cara menilai dakwaan pintasan seterusnya

Tanyakan kompleks mana yang disekat, dengan perencat apa, pada tapak mana dan dos berapa. Tanyakan kepekatan pewarna dan bila bacaan diambil. Tanyakan tisu, spesies, kaedah pengasingan, kepekatan protein dan substrat. Tanyakan juga sama ada keupayaan, respirasi, keadaan redoks dan ujian pemindahan langsung memberikan dapatan yang selaras, kerana penggunaan oksigen sahaja menunjukkan arah yang salah lebih daripada sekali dalam kajian-kajian ini.

Rumusan terhad ini tetap sah. Pintasan Kompleks I oleh pewarna disepakati. Bagi Kompleks III, mitokondria mencit dengan antimisin pada 1 microgram per ml dan pewarna pada 1 micromolar tidak menunjukkan pintasan berfungsi, manakala tiga spesies dengan antimisin pada 0.3 micromolar atau miksotiazol pada 1 micromolar dan pewarna pada 2 micromolar menunjukkan pintasan separa dengan pemindahan langsung daripada pewarna ke sitokrom c. Kedua-dua pernyataan itu boleh benar serentak. Apa-apa kesimpulan yang lebih luas ialah ekstrapolasi.

Bacaan berkaitan mengekalkan dakwaan yang dipertikaikan dalam konteks kimia yang tidak dipertikaikan: cara biru metilena memindahkan elektron untuk pemindahan berantai, eksperimen pintasan Kompleks I untuk kes hulu yang disepakati, bacaan keupayaan membran dan artifaknya untuk sebab dua pewarna diperlukan, serta pengendalian bahan yang berkitar redoks di makmal untuk perangkap berkaitan dos dan masa.