Artikel
Alternatif kepada metilena biru untuk mikroskopi: pilih mengikut tugas
Untuk sapuan bakteria ringkas, kristal violet boleh menggantikan metilena biru apabila tujuannya adalah untuk melihat bentuk sel. Bagi sel hidup, alternatif yang lebih sesuai mungkin ialah kontras fasa tanpa sebarang pewarna. Pilihan bergantung pada pemerhatian yang perlu anda buat.
Bayangkan dua orang sedang memeriksa kultur bakteria yang sama. Seorang mahu membezakan bakteria berbentuk batang daripada sel bulat. Seorang lagi mahu mengetahui sama ada sesuatu rawatan telah membunuh bakteria. Pewarna yang memberikan imej jelas kepada orang pertama mungkin tidak memberikan jawapan yang boleh digunakan kepada orang kedua.
Sebelum memilih pengganti, lengkapkan ayat ini: “Saya perlu memerhatikan ___ dalam ___, dan sel mesti / tidak perlu kekal hidup.” Ayat itu mentakrifkan tugas yang perlu dilakukan oleh pewarna tersebut.
Mulakan dengan spesimen dan soalan
Mula-mula tentukan sama ada sel mesti kekal hidup, kemudian kenal pasti ciri yang perlu diperhatikan:
- Sel mesti kekal hidup: untuk pergerakan atau bentuk, pertimbangkan kontras fasa tanpa pewarna atau DIC; untuk DNA nukleus, pertimbangkan Hoechst 33342 dengan pendarfluor; untuk integriti membran, pilih asai yang telah disahkan seperti SYTO 9 dengan propidium iodide.
- Sel tidak perlu kekal hidup: untuk morfologi bakteria, pertimbangkan pewarnaan ringkas kristal violet atau pewarnaan negatif nigrosin; untuk tindak balas Gram, gunakan kaedah pewarnaan Gram yang lengkap; untuk DNA nukleus dalam sel terfiksasi, pertimbangkan pendarfluor DAPI.
Gunakan jadual ini untuk membandingkan batasan setiap cabang. Ini ialah pilihan kaedah, bukan arahan untuk menukar botol reagen dalam protokol sedia ada.
| Perkara yang perlu diperhatikan | Spesimen dan peralatan | Alternatif yang boleh dipertimbangkan | Batasan utama |
|---|---|---|---|
| Bentuk dan susunan bakteria | Sapuan bakteria yang disediakan; medan cerah | Pewarnaan ringkas kristal violet | Menunjukkan morfologi; tidak menentukan tindak balas Gram atau daya hidup. |
| Garis luar sel pada latar belakang gelap | Penyediaan bakteriologi; medan cerah | Pewarnaan negatif nigrosin | Penyediaan dan formulasi penting; sel yang tidak diwarnakan tidak semestinya hidup. |
| Tindak balas Gram | Sapuan bakteria yang disediakan; medan cerah | Kaedah pewarnaan Gram lengkap | Memerlukan keseluruhan turutan reagen dan kawalan. |
| Pergerakan atau perubahan dalam sel hidup | Penyediaan basah yang serasi; kontras fasa atau DIC | Tiada pewarna | Memerlukan optik yang sesuai; kontras tidak mengenal pasti sesuatu molekul. |
| DNA nukleus | Sel terfiksasi; pendarfluor | DAPI | Memerlukan penapis pengujaan dan pancaran yang serasi. |
| DNA nukleus dalam sel hidup | Sel hidup; pendarfluor | Hoechst 33342 | Kemasukan ke dalam sel tidak membuktikan bahawa keadaan pengimejan tidak memudaratkan. |
| Integriti membran bakteria | Bakteria tidak terfiksasi; pendarfluor | SYTO 9 dengan propidium iodide | Pewarnaan membran ialah ukuran tidak langsung bagi daya hidup. |
Untuk sapuan ringkas, gantikan kaedah dengan berhati-hati
Kristal violet ialah calon praktikal apabila tugasnya ialah mendapatkan paparan satu warna bagi morfologi bakteria. Bacteriological Analytical Manual FDA menyenaraikan dua formulasi kristal violet yang sesuai untuk pewarnaan ringkas. Gunakan formulasi yang didokumenkan berserta kaedah penyediaannya; nama pewarna sahaja tidak menentukan reagen kerja.
Kristal violet juga digunakan dalam pewarnaan Gram, tetapi itu tidak menjadikan pewarnaan ringkas kristal violet sebagai pewarnaan Gram. Dalam protokol pewarnaan Gram ASM, keputusan pembezaan bergantung pada kristal violet, iodin, penyahwarnaan dan pewarnaan balas yang bertindak mengikut turutan. Mengabaikan langkah tersebut mengubah perkara yang boleh ditentukan daripada imej. Lihat pewarnaan ringkas berbanding pewarnaan Gram untuk perbezaan tersebut.
Nigrosin menawarkan cara yang berbeza untuk menampakkan garis luar: ia menggelapkan latar belakang manakala sel bakteria kekal secara relatifnya cerah. Terdapat butiran berguna dalam arahan nigrosin Merck yang mungkin terlepas dalam senarai umum pengganti. Formulasi kerja yang dinyatakan mengandungi formaldehid. Oleh itu, anda tidak boleh menyimpulkan keserasian dengan sel hidup hanya daripada istilah “pewarnaan negatif”, walaupun sel itu sendiri kelihatan tidak diwarnakan. Semak keseluruhan formulasi dan penyediaan spesimen.
Untuk spesimen hidup, pertimbangkan menukar optik
Jika anda mahu memerhatikan sel bergerak atau membahagi, penggunaan pewarna lain mungkin merumitkan pemerhatian. Seperti yang diterangkan Nikon dalam panduannya tentang kontras dalam spesimen lutsinar, kontras fasa dan kontras gangguan pembezaan, atau DIC, menjadikan spesimen kelihatan melalui perbezaan sifat optiknya. Kaedah ini boleh menampakkan sel hidup tanpa pewarna, dengan syarat mikroskop mempunyai komponen yang diperlukan.
Pilihan ini mengekalkan penyediaan tanpa pewarna, tetapi mengubah maklumat yang tersedia. Anda boleh mengikuti sempadan atau pergerakan tanpa mengetahui molekul yang menghasilkan kontras tersebut. Jika persoalannya ialah penyetempatan molekul, pilih kaedah pelabelan yang sesuai.
Untuk DNA nukleus, perbandingan pewarna DAPI dan Hoechst oleh Invitrogen membezakan penggunaan lazim DAPI dengan sel terfiksasi daripada Hoechst 33342 yang lebih mudah menembusi sel dan lebih sesuai untuk pelabelan sel hidup. Kedua-duanya memerlukan peralatan pendarfluor. Kedua-duanya bukan pengganti langsung bagi pewarna berwarna untuk medan cerah.
Anggap pendedahan kepada pewarna dan pencahayaan sebagai keadaan eksperimen. Bandingkan penyediaan yang diwarnakan dan tidak diwarnakan apabila tingkah laku sel ialah ukuran anda.
Sel merah tidak semestinya sel mati
SYTO 9 dan propidium iodide sering digunakan bersama untuk menilai integriti membran bakteria. Manual BacLight mengaitkan membran utuh dengan pewarnaan hijau dan membran rosak dengan pewarnaan merah. Tafsiran tersebut perlu disahkan untuk spesimen berkenaan.
Satu kajian 2019 oleh Rosenberg dan rakan-rakan menggambarkan masalah tersebut. Dalam biofilem E. coli berusia 24 jam pada kaca dalam larutan garam berpenimbal fosfat, kira-kira 96% sel kelihatan positif propidium iodide secara in situ. Namun, penulis menganggarkan bahawa 82% masih boleh dikultur selepas penuaian. Imej konfokal menunjukkan sel dengan bahagian dalam berwarna hijau di bawah bahan yang diwarnakan merah, menunjukkan bahawa asid nukleik ekstrasel menyumbang kepada isyarat yang mengelirukan.
Peratusan tersebut menerangkan ukuran yang berbeza pada penyediaan kajian itu, bukan faktor pembetulan sejagat. Pengajaran yang berguna ialah memeriksa perkara yang menghasilkan isyarat. Dalam biofilem, pewarna asid nukleik boleh mengesan bahan di luar sel serta di dalam sel yang rosak. Untuk membuat kesimpulan tentang daya hidup, penyelidik mengesyorkan ukuran pelengkap seperti pengkulturan atau aktiviti metabolik, sambil mengakui bahawa setiap kaedah mempunyai batasannya.
Semak kandungan sebenar alternatif
Kaedah pewarnaan alternatif mungkin masih mengandungi metilena biru. Giemsa ialah satu contoh: Merck menerangkan produknya sebagai larutan azure-eosin-methylene-blue, yang dimaksudkan untuk aplikasi termasuk sapuan darah dan sumsum tulang. Ia boleh menjadi kaedah berbeza untuk spesimen yang berbeza, tetapi tidak memenuhi keperluan untuk mengecualikan metilena biru.
Jika pengecualian sesuatu sebatian ialah sebahagian daripada eksperimen, semak identiti dan formulasi reagen sebelum membandingkan imej. Panduan tentang methyl blue, methylene blue dan pewarna dengan nama yang serupa menerangkan perbezaan penamaan.
Sahkan penggantian sebelum menggunakan hasilnya
Untuk kaedah baharu, buat perbandingan kecil menggunakan spesimen yang mewakili keadaan sebenar dan kawalan yang sesuai. Pastikan tetapan mikroskop boleh dibandingkan jika boleh. Rekod formulasi reagen, penyediaan spesimen, pendedahan dan keadaan pengimejan supaya imej yang kelihatan lebih baik boleh disiasat, bukan sekadar dipilih berdasarkan rupa.
Nilai kejayaan berdasarkan soalan asal. Untuk morfologi, nilai sama ada sempadan dan susunan sel masih boleh ditafsirkan. Untuk pelabelan nukleus, nilai lokasi isyarat dan latar belakang. Untuk daya hidup, perlukan bukti selain pemisahan warna yang menarik. Panduan yang lebih luas tentang pewarnaan metilena biru dan aplikasi makmal menerangkan bagaimana pemerhatian dan penyediaan saling berkaitan.
Pilih alternatif yang mengekalkan ukuran yang anda perlukan. Warna hanyalah satu sifat imej yang terhasil.