Идентификација на метиленско сино во лабораторија: инфрацрвени спектри и дополнителни методи

Замислете дека три лаборатории добиваат ист син прашок. Првата снима инфрацрвен спектар и го идентификува како метиленско сино. Втората врши хроматографска анализа и пријавува 0.4% Azure B. Третата ја испитува дифракцијата на рендгенските зраци од кристалите и ја утврдува хидратната форма. Сите три се во право, но ниту една не одговорила на другите две прашања. Забуната започнува кога еден резултат се толкува како одговор на сите три.

Оваа статија ги разграничува тие прашања. Инфрацрвената идентификација го утврдува молекуларниот идентитет преку споредба со референтен стандард. Хроматографијата го утврдува составот. Дифракцијата ја утврдува формата во цврста состојба. Успешното совпаѓање при идентификацијата не е сертификат за чистота.

Инфрацрвената идентификација добро одговара на едно прашање

Фармакопејскиот тест за идентификација на метиленско сино е споредба на спектарот со стандард, а не проверка според список на пикови. Во прегледот на монографијата на USP за метиленско сино, Идентификација A наведува инфрацрвена спектроскопија со ATR-оптика или со таблета од калиум бромид. Спектарот на примерокот мора да соодветствува со спектарот на референтниот стандард на USP, при што примерокот и стандардот треба да бидат подготвени и снимени во еквивалентни услови. Одлуката не се заснова на фиксен список на дијагностички бранови броеви. Таа се заснова на преклопувањето на спектрите.

Овој пристап го одразува однесувањето на FTIR-спектрите на метиленското сино. Најсилните спектрални карактеристики се наоѓаат во областа на спектралниот отпечаток. Според доделувањата во литературата, главната лента на конјугираниот прстен доследно се наоѓа околу 1590 до 1600 cm-1, каде што се спрегнуваат вибрациите на истегнување на ароматичните јаглерод-јаглерод и јаглерод-азот врски. Други ленти околу 1490 и 1390 cm-1 се поврзани со деформации на прстенот, јаглерод-азот и јаглерод-водород врските. Лентите околу 1355 и 1330 cm-1 ги вклучуваат јаглерод-азот врските на диметиламино-групите и деформациите на метилните групи. Спектралните карактеристики околу 1225 до 1250 cm-1 припаѓаат на хетероцикличниот скелет, додека лентите околу 1170 до 1130 и 1066 cm-1 се поврзани со јаглерод-сулфур врските, со свиткување на ароматичните C-H врски околу 880 cm-1. Вибрациите на истегнување се појавуваат при повисоки бранови броеви: ароматичните C-H околу 3040 cm-1, а N-метилните C-H приближно меѓу 2900 и 3000 cm-1. Објавените доделувања се разликуваат во деталите бидејќи фенотиазиниумскиот скелет вибрира како спрегнат систем, па секоја поединечна табела со доделувања треба да се смета за пријавено толкување, а не за единствено можно.

Два ефекта од подготовката заслужуваат внимание бидејќи ги менуваат IR-спектрите на метиленското сино без да ја менуваат бојата како соединение. Прво, хидратираниот материјал покажува широка O-H спектрална обвивка околу 3300 до 3500 cm-1, како и вибрации на свиткување на водата околу 1630 до 1640 cm-1, а различните хидратни форми мерливо ги поместуваат лентите во областа на спектралниот отпечаток. Второ, матрицата на таблетата од KBr е хигроскопна: апсорбираната влага создава ленти токму во тие области за водата и може погрешно да се протолкува како хидратна вода од примерокот. Мерењето со ATR ја избегнува матрицата од KBr, но интензитетите кај ATR зависат од длабочината на продирање, која се менува со брановиот број, па ATR-спектар и трансмисионен спектар на истиот прашок не можат директно да се преклопат. Практичното правило произлегува од фармакопејското барање: споредувајте примерок и референтен стандард снимени со иста техника и документирајте која техника е користена. За хемијата на катјонот, солта и хидратите што стојат зад овие спектри, погледнете го референтниот преглед на структурата и својствата на метиленското сино.

Табела за избор на аналитички метод

Оваа табела е алатка за избор. Читајте го секој ред за да видите на кое прашање одговара методот, што потврдува резултатот што ги исполнува критериумите и што останува недокажано.

Зошто совпаѓањето на инфрацрвените спектри не е сертификат за чистота

Совпаѓањето при идентификацијата исклучува погрешна боја. Тоа не ги попишува сите состојки на примерокот. Најважни се три ограничувања.

Прво, блиските сродни соединенија изгледаат слично во инфрацрвеното подрачје. Azure B се разликува од метиленското сино само по една метилна група, па неговиот спектар многу наликува на спектарот на метиленското сино. Смеса што содржи неколку проценти Azure B и понатаму добро се преклопува со референтен спектар на метиленско сино. Откривањето на таа нечистотија е задача за хроматографијата, опфатена во водичот за нечистотии во метиленското сино и методи за испитување.

Второ, инфрацрвената спектроскопија е техника што го испитува материјалот како целина, со ограничена чувствителност кон компонентите присутни во мали количества. Малите количества сродни бои, резидуални растворувачи или неоргански остатоци се прикриени под главните ленти. Отсуството на дополнителни пикови е слаб доказ за отсуство на нечистотии.

Трето, референтниот стандард ја определува целата споредба. Деградиран стандард, стандард со поместен спектар поради хидратација или стандард со кој се постапувало неправилно ја менува основата за оценување. Истото важи и за споредба на неусогласени техники, како кога ATR-спектар на примерок се оценува според референтен спектар добиен со KBr. Заедно со секој заклучок, запишувајте ја серијата на стандардот, техниката и подготовката.

Смесите бараат уште едно предупредување. Спектар што главно се совпаѓа, но има рамена или аномалии во интензитетот, не е позитивен резултат со забелешки. Тоа е сигнал дека примерокот треба да се раздвои пред да се идентификува.

Дополнителни методи во практиката

HPLC-анализата на метиленското сино го дава одговорот за составот што инфрацрвената спектроскопија не може да го даде. Тековниот фармакопејски метод користи колона од фенилен тип со градиент вода-ацетонитрил што содржи трифлуороцетна киселина, а детекцијата се врши на 246 nm, не во видливото подрачје. Идентитетот се утврдува преку совпаѓање на ретенционото време со референтниот стандард; истата споредба служи и за квантитативното определување. Тестот за органски нечистотии го идентификува Azure B со сопствен референтен материјал, при релативна ретенција околу 0.8 во однос на метиленското сино на 1.0, и бара висока резолуција меѓу двата пика. Обрнете внимание на изборот на бранова должина: серијата на деметилирани бои апсорбира сè подалеку кон црвениот дел од спектарот, од тионин околу 600 nm, преку Azure C, Azure A и Azure B, до метиленско сино околу 670 nm. Затоа детектор поставен околу 660 nm реагира нееднакво кај членовите на серијата и ги потценува количествата на некои хомолози. Целосното профилирање на целата серија, кога е потребно, треба да се изврши со C18 LC-MS/MS метод со квалификувани стандарди за секој аналит.

Прашковата дифракција одговара на прашањето за цврстата состојба, чии информации двата претходни метода ги уништуваат или ги занемаруваат: растворањето на прашокот за хроматографија ги брише информациите за кристалите, а молекуларните вибрации даваат информации за врските, наместо за подредувањето на големи растојанија. Дифракционите обрасци ги разликуваат хидратните фази и кристалноста, а кај метиленското сино ваквата проверка е попотребна отколку кај повеќето материјали. Истражувањата на цврстата состојба на Рагер и соработниците идентификувале пет различни хидратни структури, вклучувајќи пентахидрат, два дихидрата, монохидрат и меѓуформа на хидрат, а меѓу карактеризираните форми не нашле вистински трихидрат. Лабораториското постапување е важно: влажноста и температурата ја менуваат стабилноста на хидратите, а агресивното мелење може да ја измени фазата или да ја намали кристалноста. Затоа контролирајте ги и документирајте ги релативната влажност и температурата и сведете го мелењето на минимум. Означувањето на хидратите и неговото влијание врз измерената маса се подетално разгледани во хидратни форми на метиленско сино и нивно означување.

UV-Vis апсорпцијата има помошна улога. Познатите максимуми го потврдуваат очекуваното однесување на растворот и овозможуваат определување на концентрацијата, но син раствор што апсорбира на очекуваната бранова должина е во согласност со присуството на метиленско сино без да го докажува, бидејќи сродните бои апсорбираат во близина.

Што да прашате пред купување

Преточете ги овие разлики во прашања при набавката. Прашајте која серија е испитана, со која техника е утврден идентитетот, дали во HPLC-тестот за нечистотии е користен референтен материјал за Azure B и дали хидратната форма е карактеризирана или само претпоставена. Пред сè, прашајте дали сертификатот ја опфаќа целосната спецификација или само избрани тестови. Многу продавачи што тврдат дека производот ги исполнува фармакопејските барања испитуваат само тешки метали, оставајќи ги неодговорени прашањата за идентитетот, содржината, органските нечистотии, растворувачите и микробиолошките параметри.

Blupreme врши испитувања според целосната спецификација на USP, опфаќајќи идентитет, чистота, органски нечистотии, резидуални растворувачи, елементни нечистотии, остаток по жарење, микробиолошки граници и бактериски ендотоксини, во партнерство со фармацевтски производител на метиленско сино. Јавниот сертификат за анализа за секоја серија е објавен на испитување на квалитетот во Blupreme, така што основата за квантитативното определување и резултатите за нечистотиите можат директно да се прочитаат, наместо да се претпоставуваат. И кај резултати блиску до 100% треба да се наведе основата за пресметување, како што објаснува водичот за определена содржина над 100 проценти. Совпаѓањето при идентификацијата го започнува испитувањето. Целосната документација го заокружува.