Metilēnzilā vēsture: no krāsvielas līdz zālēm un pētniecībai

Metilēnzilais nonāca pie pacienta, pirms tas nonāca aptiekā.

Paul Guttmann un Paul Ehrlich 1891. gada ziņojumā par krāsvielas izmantošanu malārijas gadījumā ir divas temperatūras diagrammas. Otrā aptver laiku no 13 July līdz 5 August, un gar malu pa dienām ir norādīta ārstēšana. 18 un 19 July ierakstos lasāms "1 × 0,05 Methylenblau". Turpmākajās dienās norādītas piecas un septiņas tāda paša daudzuma devas, un līdz 22 July pierakstiem pievienots neliels daudzums hinīna. Drudža līkne, kas diagrammas pirmajā pusē svārstās starp 37 °C un 39.5 °C, pēc krāsvielas parādīšanās izlīdzinās un atlikušās trīs nedēļas saglabājas aptuveni starp 36 °C un 37.5 °C.

Pacients bija viens no diviem cilvēkiem, kas publikācijā aprakstīti kā mājkalpotājs un jūrnieks. Savienojums, ko viņi saņēma, jau piecpadsmit gadus bija komerciāla tekstilkrāsviela, un abi vīrieši ir vieni no pirmajiem dokumentētajiem cilvēkiem, kuri ārstēti ar pilnībā sintētiskām zālēm, kas bija vērstas pret konkrētu organismu.

Vispirms bija krāsviela

Pirmo komerciāli veiksmīgo sintētisko krāsvielu William Henry Perkin radīja 1856. gadā. Perkin bija astoņpadsmit gadus vecs, Lieldienu brīvdienās strādāja mājas laboratorijā un mēģināja sintezēt hinīnu. Tā vietā viņš ieguva melnu atlikumu, izšķīdināja to un atklāja krāsu, kas izcili nostiprinājās uz zīda. Viņš to patentēja 1856. gada August, un līdz 1857. gada beigām viņam jau bija rūpnīca, kas apgādāja Londonas zīda krāsotavu.

1875. gadā Adolf von Baeyer sintezēja sarkanu krāsvielu un nosauca to par eozīnu — no Eos, grieķu vārda, kas apzīmē rītausmu. 1876. gadā Heinrich Caro, tolaik Badische Anilin- und Soda-Fabrik laboratorijas direktors, kopā ar Baeyer izstrādāja metilēnzilo kā anilīna bāzes krāsvielu kokvilnai. Tā ķīmiskā struktūra tika galīgi noteikta tikai aptuveni deviņus gadus vēlāk.

Šī izcelsme joprojām ir redzama vielas nosaukumā. "Methylene blue" ir krāsvielu kataloga tirdzniecības nosaukums, nevis ķīmisks apraksts. Savienojums, uz kuru tas attiecas, ir metiltionīnija hlorīds, un atšķirībām starp nosaukumu, sāli un tā hidrātiem ir nozīme, tiklīdz kāds sver materiālu vai lasa specifikāciju.

Krāsošana bija tilts

Ceļš no krāsvielu ražotnes uz slimnīcu veda caur mikroskopu, un tas sākās vēl pirms metilēnzilā radīšanas. Wilhelm Erb bija pirmais, kurš asinīm izmantoja sintētisku krāsvielu, 1865. gadā lietojot pikrīnskābi, un dažu eritrocītu iekšienē novēroja retikulāru rakstu.

Paul Ehrlich 1878. gada doktora disertācijā salīdzināja histoloģisko krāsošanu ar tekstilizstrādājumu krāsošanu un argumentēja, ka abas ir ķīmiskas reakcijas. Strādājot Robert Koch vadībā ar tuberkulozes bacili, viņš sadalīja anilīna krāsvielas skābajās un bāziskajās klasēs un konstatēja, ka katra klase iekrāso atšķirīgas šūnas daļas. 1880. gadā viņš abas sajauca: piesātinātu metilēnzilā šķīdumu pievienoja skābajam fuksīnam, līdz virsējais šķidrums kļuva dzidrs. Rezultāts, ko viņš nosauca par neutralen Farbkörper jeb neitrālo krāsojumu, radīja trīs krāsas vienas vietā, atklāja granulas polimorfonukleārajās šūnās, kas iepriekš nebija redzamas, un padarīja iespējamu pirmo leikocītu diferenciālo skaitīšanu. Tā kā šīs granulas uzņēma abas maisījuma sastāvdaļas, Ehrlich šūnām, kurās tās atradās, ieviesa nosaukumu neitrofils.

Divus gadus vēlāk Koch izmantoja metilēnzilo, lai atrastu tuberkulozes bacili, un 1883. gadā Ehrlich šo metodi uzlaboja. 1886. gadā viņš publicēja cita veida novērojumu: viņš injicēja krāsvielu dzīviem dzīvniekiem un salīdzināja, cik spēcīgi to uzņem katrs orgāns, secinot, ka tai ir izteikta afinitāte pret smadzeņu un nervu audiem. Šo afinitāti viņš saistīja ar krāsvielas oksidēšanās-reducēšanās cikliskumu, ko bija novērojis iepriekšējā gadā. Šī cikliskuma dēļ metilēnzilā šķīdums arī zaudē krāsu, kad tiek patērēts tajā esošais skābeklis, un atgūst to, kad atkal piekļūst gaiss. Eksperimenti, kuros pirmoreiz izmērīja šī cikliskuma sekas, pieder vēlākai desmitgadei, un pats mehānisms ir atsevišķs temats no vēstures.

Parazīts un violetais kodols

Alphonse Laveran 1880. gadā atklāja malārijas parazītu, pētot svaigas, nekrāsotas asinis. Lai to regulāri saskatītu izžāvētā uztriepē, bija nepieciešams krāsojums, bet tālaika krāsvielas deva tikai sarkano un zilo krāsu.

1888. gadā poļu patologs Czesław Cheçinski aizstāja skābo fuksīnu ar eozīnu, izveidojot metilēnzilā un eozīna maisījumu. Viņa metodes pamatā bija gadījums ar karavīru, kurš 1887. gada 30 September nomira no malārijas. Asins preparātos Cheçinski redzēja zilas, margrietiņām līdzīgas formas, kas tagad atzītas par Plasmodium malariae, un sirpjveida formas, kas tagad atzītas par Plasmodium falciparum gametocītiem. Rezultāts vienlaikus izbeidza divus konkurējošus slimības skaidrojumus: miasmu teoriju un Edwin Klebs un Corrado Tommasi-Crudeli apgalvojumu, ka malāriju izraisa baktērija.

Parazīts bija redzams. Tā kodols nebija, tāpēc tā būtība palika neskaidra. Breslavas ārsts Ernst Malachowski šo problēmu atrisināja vispirms nejauši, pēc tam apzināti. 1889. gadā viņš kādā preparātā pamanīja plazmodija kodola diferenciālu iekrāsošanos, taču nespēja to atkārtot. Metilēnzilā paskābināšana nepalīdzēja. Padarot to sārmainu ar boraksu, efekts radās katru reizi. Viņš publiski demonstrēja šo paņēmienu 1890. gada 15 June un tajā pašā gadā to publicēja, bet detalizētāku metodi publicēja 1891. gada August.

Dmitri Romanowsky savu versiju publicēja 1891. gada September. Vislabākos rezultātus viņš ieguva no vairāk nekā divus mēnešus vecas, novārtā atstātas, sapelējušas metilēnzilā šķīduma pudeles. Malachowski aprakstītā metode bija apzināta un, pēc viņa vārdiem, viegli reproducējama; Romanowsky pieeja bija strupceļš, kas nostrādāja vienreiz. Tomēr eponīms tika Romanowsky, un strīds par to, kurš radīja violeto krāsojumu, kas padarīja kodolu redzamu, ir atsevišķs stāsts ar saviem dokumentiem.

Attēls: otrā temperatūras diagramma no Guttmann un Ehrlich 1891. gada ziņojuma. Augšējais panelis aptver laiku no 13 līdz 24 July, bet apakšējais — no 25 July līdz 5 August; ierakstos malā norādītas ievadītās devas, un pēdējās trīs ieraksta nedēļas temperatūra saglabājas tuvu normālai. Reproducēts no ziņojuma skenējuma, kas izmantots Krafts, Hempelmann un Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Nogatavināšana izrādījās demetilēšana

Neviens no 1890s iesaistītajiem nezināja, ko metilēnzilajam izdara "nogatavināšana". Atbilde nāca no rūpnieciskās ķīmijas. Heinrich August Bernthsen 1883. gadā bija sintezējis pamatsavienojumu fenotiazīnu, 1885. gadā konstatēja, ka metilēnzilais pieder šai savienojumu grupai, un tajā pašā periodā parādīja, ka sārmaini apstākļi atšķeļ no krāsvielas metilgrupas, veidojot savienojumus, ko tagad sauc par azūriem.

Bernard Nocht 1898 un 1899. gadā izdalīja aktīvo frakciju un varēja to nosaukt tikai par Rot aus Methylenblau — sarkano no metilēnzilā. Michaelis 1901. gadā identificēja to kā azure I. Jenner 1899. gadā ieviesa absolūto metanolu kā šķīdinātāju krāsvielas nogulsnēm, tā novēršot nepieciešamību asins preparātus termiski fiksēt; Leishman un Reuter apvienoja abus uzlabojumus; Wright 1902. gadā publicēja vienkāršotu metodi. Giemsa ieguldījums, arī 1902. gadā, bija atteikšanās no nejauši nogatavināta šķīduma un tā vietā izmantot izmērītus zināmu krāsvielu daudzumus. Pēc tam viņš atteicās publicēt, kā iegūst tīru metilēnazūru, un pārdeva metodi Dr. Grübler laboratorijai, kas produktu tirgoja kā azure I un apgalvoja, ka tikai tās versija ir autentisks Giemsa krāsojums.

Divi pasaules kari šo procesu nejauši pabeidza. Kad vācu krāsvielas kļuva nepieejamas, Lillie, Roe un Wilcox pētīja amerikāņu aizstājējus un atklāja, ka vislabāko krāsojumu dod trīs atdalīti komponenti: tīrs metilēnzilais, tā sadalīšanās produkts azure B un eozīns. Šie trīs joprojām ir galvenās sastāvdaļas krāsojumā, ko mūsdienās izmanto malārijas diagnostikā un kura nosaukums tagad apvieno Malachowski, Wright un Giemsa.

Attēls: Plasmodium falciparum gredzenveida formas cilvēka eritrocītos, iekrāsotas ar Romanowsky tipa metodi. Violetā struktūra gredzena iekšpusē ir hromatīns, ko Malachowski ar boraksu apstrādātais metilēnzilais pirmoreiz padarīja redzamu. Ernst Hempelmann attēls, nodots publiskajā īpašumā.

Viens nosaukums, vairāki materiāli

Gadi, kas bija vajadzīgi šo komponentu atdalīšanai, atstāja problēmu, kura pārdzīvoja pašu ķīmijas attīstību. Ralph Lillie 1969. gadā novilka robežu starp bioloģiskajām krāsvielām, kas "ražotas atbilstoši stingrām specifikācijām, kas atbilst to delikātajam un prasīgajam lietojumam", un nebioloģiskajām krāsvielām tekstilizstrādājumu krāsošanai, kurām "vajadzīgi mazāk stingri un prasīgi ražošanas standarti". Abu veidu produktiem bija viens un tas pats nosaukums, un atšķirība starp tiem nekad nebija tikai pakāpes jautājums. Kokvilnai paredzēta specifikācija un diagnostiskam reaģentam paredzēta specifikācija nav savstarpēji aizvietojamas, un materiāls, kas izgatavots atbilstoši tekstilizstrādājumu specifikācijai, nebija paredzēts norīšanai.

Azure B ir visskaidrākais piemērs. Tā ir metilēnzilā monodemetilētā forma, tai pašai ir izmērāma farmakoloģiska aktivitāte, un vairāk nekā gadsimtu tā bija nekontrolēta klīnisko metilēnzilā preparātu sastāvdaļa, pirms kāds šīs abas vielas atdalīja. Viena pētnieku grupa konstatēja, ka autopsijā ņemti cilvēka audi pēc metilēnzilā ievadīšanas saturēja 5 līdz 14 per cent neizmainīta metilēnzilā un 86 līdz 95 per cent azure B. Tas, vai konkrētam preparātam vajadzētu saturēt azure B un kādā robežvērtībā, ir specifikācijas jautājums, un pētījumi par azure B kā piemaisījumu un metabolītu šo tēmu turpina.

Specifikācijā atrodas arī praktiskās sekas. Atbilstība USP ir ceļš uz augstāko tīrību, ko piedāvā tirgus, jo tas ir pilnīgs publicēts testēšanas standarts, nevis viens mērījums. Tas aptver identitāti, aktīvās vielas saturu, organiskos piemaisījumus, tostarp azūra krāsvielas, atlikušos šķīdinātājus, elementāros piemaisījumus, atlikumu pēc karsēšanas, mikrobioloģiskās robežvērtības un baktēriju endotoksīnus. Sertifikātā, kurā norādīts smago metālu rezultāts un tas nosaukts par atbilstību USP, ir norādīta tikai viena šī saraksta pozīcija.

Blupreme iegūst metilēnzilo no farmaceitisko produktu ražotāja un publicē pilnu analīzes sertifikātu, pārbaudot visu USP specifikāciju, nevis tikai smagos metālus. Ceļvedis analīzes sertifikāta lasīšanai un tas, ko USP apzīmējums pierāda un ko nepierāda, izskaidro, kā dokumentu salīdzināt ar attiecīgo apgalvojumu.

Ko vēsture pamato un ko tā nepamato

Šī vēsturiskā līnija ir reāla un garāka, nekā liek domāt vairums produktu lapu. Metilēnzilais tika izmantots malārijas ārstēšanā 1891. gadā, 1899. gadā par to ziņoja kā par sedatīvu līdzekli uzbudinātas psihozes gadījumā, un tā sānu ķēdes ķīmiskā līnija ved caur hinakrīnu, hlorokvīnu, prometazīnu un hlorpromazīnu. Ehrlich 1890. gada publikācijā kopā ar Arthur Leppmann aprakstīja neiralģisku un reimatisku sāpju mazināšanos un pēc tam apsvēra, bet atteicās pārbaudīt krāsvielu garīgu slimību gadījumā.

Nekas no tā nepamato mūsdienu lietojumu. 1891. gada malārijas rezultāts balstījās uz diviem pacientiem un vienu temperatūras diagrammu. Ilgstoša pazīstamība ar molekulu ir iemesls to pētīt, nevis pētījuma rezultāts. Savienojuma kā zāļu vēsture un mūsdienu pētījumi par malāriju atbild uz citiem jautājumiem nekā tie, ko uzdeva Ehrlich, un to galarezultāti jāvērtē atbilstoši pašu pētījumu nosacījumiem.

Vēsturiskajos avotos ir viena detaļa, kas pieder tagadnei, nevis pagātnei. Kad pētnieki 2000s Burkina Faso veica metilēnzilā pētījumus malārijas jomā, viņiem nācās konkurēt par farmaceitiskas kvalitātes materiālu, un viņi ziņoja, ka izejmateriāla cena bija pieaugusi aptuveni simtkārtīgi, tiklīdz tam bija GMP validācija. Krāsvielu varēja aizstāt. Zāles nevarēja. Atšķirība, ko Lillie formulēja 1969. gadā, ir tā pati, kas arī šodien nosaka, kas atrodas pudelē.