Straipsnis
Metileno mėlynojo redukcijos testas pienui: principas ir ribotumai
Studentė pakelia du mėgintuvėlius su pienu. Viename pienas pabalo per valandą. Kitame jis penkias valandas liko mėlynas. Ji rodo į mėlynąjį ir sako, kad šį pieną saugu gerti.
Tokia išvada atskleidžia klaidingą supratimą. Pieno testas su metileno mėlynuoju nenustato saugumo. Jis parodo, kaip greitai mikroorganizmų populiacija tame mėgintuvėlyje sumažina redokso potencialą nustatytomis sąlygomis. Lėtas rezultatas reiškia mažą bendrą mėginio metabolinį aktyvumą. Jis nieko nepasako apie tai, kokie mikroorganizmai yra mėginyje, ar tarp jų yra patogenų ir ar pienas buvo tinkamai pasterizuotas.
Šis skirtumas svarbus, nes testas atrodo įtikinamas. Mėlyna spalva išnyksta. Laikrodis pateikia skaičių. Skaičius norisi interpretuoti pernelyg plačiai. Šiame straipsnyje išsaugoma naudinga interpretacija ir atmetama nesaugi.
Ką iš tikrųjų matuoja redukcija
Oksiduotas metileno mėlynasis yra mėlynas, o redukuotas iki leukometileno mėlynojo – beveik bespalvis. Šviežiame piene yra ištirpusio deguonies, kuris palaiko mėlyną dažiklio spalvą. Kvėpuojančios ir fermentuojančios bakterijos sunaudoja šį deguonį ir išskiria redukuojančius junginius. Kai redokso potencialas pakankamai sumažėja, dažiklis priima elektronus ir praranda spalvą. Gvelfo universiteto pieno mikrobiologijos vadovėlyje aprašoma ta pati seka: pirmiausia pašalinamas deguonis, paskui bakterijų metabolizmo metu susidaro redukuojančios medžiagos.
Klasikiniuose žurnalo „Journal of Dairy Science“ darbuose tai apibūdinama kaip dviejų etapų procesas: mikroflora pirmiausia išeikvoja deguonį, tada pieno sudedamosios dalys greitai redukuoja dažiklį. Taigi metileno mėlynojo redukcijos testą pienui geriausia suprasti kaip funkcinį bendro metabolinio aktyvumo tyrimą, o ne ląstelių skaičiavimo priemonę. Metileno mėlynojo redokso savybės paaiškina šio virsmo chemiją.
Deguonis pakeičia galutinį rezultatą į priešingą. Redukuota leukodažiklio forma, veikiama oro, vėl oksiduojasi ir pamėlynuoja. Todėl purtymas, perpylimas, platūs mėgintuvėliai ir didelė oro erdvė virš mėginio atitolina rezultatą. Kai pagrindinis mėgintuvėlio turinys jau netenka spalvos, ties sąlyčio su oru paviršiumi dažnai išlieka plonas mėlynas žiedas. Pagal standartines procedūras toks žiedas priimtinas ir nelaukiama, kol jis išnyks.
Mikroorganizmų tipas yra antras rezultatą iškreipiantis veiksnys. Koliforminės bakterijos ir daugelis pieno rūgšties mikroorganizmų dažiklį redukuoja greitai. Daugelis psichrotrofinių ir karščiui atsparių mikroorganizmų jį redukuoja lėtai arba beveik visai neredukuoja. Dviejuose pieno mėginiuose, kuriuose pasėlio lėkštelėse nustatomas toks pats mikroorganizmų skaičius, mėlyna spalva gali išnykti kelių valandų skirtumu. Vien šis faktas neleidžia laiko perskaičiuoti į kolonijų skaičių.
Kontroliuojama laboratorinė procedūra
Lauko sąlygomis taikomos ir vadovėliuose aprašytos versijos skiriasi detalėmis, todėl rezultatas galioja tik pagal metodą, kuriuo jis gautas. Įprasta maisto laboratorijos procedūra atliekama taip:
- Paimkite žalio pieno mėginį kuo mažiau jį aeruodami ir nedelsdami atšaldykite. Prieš imdami mėginio dalį, sumaišykite švelniai vartydami.
- Į sterilų mėgintuvėlį įpilkite 10 mL pieno ir 1 mL darbinio dažiklio tirpalo. Viena plačiai naudojamų darbinių dažiklio koncentracijų yra 0.005 procento, kai pieno ir dažiklio santykis yra 10 ir 1.
- Užkimškite mėgintuvėlį, du kartus švelniai apverskite ir per kelias minutes įdėkite į vandens vonelę. Įprasta inkubavimo temperatūra yra nuo 35 iki 38 laipsnių Celsijaus, priklausomai nuo konkretaus standarto. Užrašykite, kuriuo standartu vadovaujatės.
- Inkubavimo metu saugokite mėgintuvėlius nuo šviesos, nes ji spartina redukciją.
- Rezultatą įvertinkite po 30 minučių, vėliau – nustatytais intervalais. Galutinis taškas yra laikas, kai mėgintuvėlio spalva atitinka virinto pieno etaloną arba pasiekiamas procedūroje apibrėžtas spalvos išnykimas.
- Kai metodas to reikalauja, palikite mėgintuvėlį su tuo pačiu pienu be reagento kaip vizualinę kontrolę.
FAO pieno tyrimų vadove pateikiama aiški šios sekos versija lauko sąlygoms: 10 mL pieno ir 1 mL dažiklio, užkimšimas, švelnus vartymas, inkubavimas maždaug nuo 37 iki 38 laipsnių temperatūroje ir rezultatų vertinimas kas 30 minučių. Kontroliniuose mėgintuvėliuose naudojamas virintas pienas, kad būtų sunaikinta natūrali redukuojanti sistema ir sukurtas spalvos palyginimo atskaitos taškas.
Aukščiau pateikta schema apibrėžia kontroliuojamas sąlygas. Tie patys tūriai, tas pats dažiklis, ta pati temperatūra, toks pats maišymas, tokia pati apsauga nuo šviesos ir ta pati galutinio taško nustatymo taisyklė. Pakeitus bet kurį iš šių veiksnių, pasikeičia ir laikas. Todėl namuose atliekamų bandymų su savavališkai pasirinkta dažiklio koncentracija negalima lyginti su laboratorinėmis kokybės kategorijomis.
Ką rodo redukcijos laikas
Ilgesnis laikas reiškia mažesnį bendrą aktyvumą nurodytomis sąlygomis. Trumpesnis laikas reiškia didesnį bendrą aktyvumą. Pieno mikrobiologijos mokomosiose lentelėse šiems laikams priskiriamos apytikslės kokybės kategorijos. Pavyzdžiui, vienoje pagal BIS sudarytoje schemoje 5 ar daugiau valandų vertinama kaip labai gera kokybė, o mažiau nei 30 minučių – kaip prasta.
Esminė pamoka – vertinimų įvairovė. 5 valandų rezultatas neturi universalios kokybės kategorijos. Jis priklauso procedūrai, kurioje buvo apibrėžtas. Todėl pagrįstas rezultato pateikimo formatas yra toks:
MBRT yra X valandų pagal įvardytą metodą ir atitinka to metodo kokybės kategoriją.
Niekada negalima teigti, kad MBRT yra X kolonijas sudarančių vienetų viename mL. Pagal „Standard Methods“ parengtos gairės nurodo, kad dažiklio redukcijos rezultatų negalima pateikti kaip bakterijų skaičiaus. Paprastojo dažymo metileno mėlynuoju procedūra taip pat atsako į kitą klausimą: ji parodo ląstelių formą mikroskopu, o ne bendrą aktyvumą mėgintuvėlyje.
Interpretacijos ir ribotumų lentelė
Ši lentelė yra originali straipsnio informacinė medžiaga. Skaitykite visą eilutę. Nė vieno langelio negalima vertinti atskirai.
| Stebėjimas arba teiginys | Ką tai rodo | Ko tai negali įrodyti | Pagrindiniai rezultatą iškreipiantys veiksniai |
|---|---|---|---|
| Greitas mėlynos spalvos išnykimas, per mažiau nei 2 valandas pagal vieną žalio pieno vertinimo schemą | Didelis redukuojantis aktyvumas, suderinamas su gausiu mikroorganizmų kiekiu arba prastu laikymosi stabilumu | Rūšies, tikslaus skaičiaus, toksinų ar pasterizavimo nesėkmės | Laikymas šiltai, mikroflora su gausiomis koliforminėmis bakterijomis, šviesa, mažas dažiklio kiekis |
| Tarpinis laikas, nuo 2 iki 4 valandų | Vidutinis aktyvumas; kokybės kategorija galioja tik pagal įvardytą schemą | Saugumo arba lėtai redukuojančių mikroorganizmų nebuvimo | Aukšta inkubavimo temperatūra, aeravimo skirtumai, riebalų atsiskyrimas |
| Lėta redukcija, 5 ar daugiau valandų | Mažas bendras aktyvumas pagal tą schemą | Patogenų nebuvimo, pasterizavimo ar cheminės saugos | Antibiotikų likučiai, konservantai, papildomas ištirpęs deguonis, didelis dažiklio kiekis |
| Paviršiuje išlieka mėlynas žiedas, o pagrindinis turinys netenka spalvos | Pakartotinė oksidacija ties sąlyčio su oru riba, įprastas pakraščio efektas | Nepavykusio testo ar nebaigtos reakcijos | Platus mėgintuvėlis, nesandarus kamštis, pakartotinis atidarymas apžiūrai |
| Baltas mėgintuvėlio turinys po kaitinto pieno inkubavimo | Pakitusi redukuojanti sistema ir išlikęs aktyvumas | Kad kaitinimas prilygo patvirtintai pasterizavimo procedūrai | Šiluminis mikroorganizmų pažeidimas, atsikūrimas inkubavimo metu, vėlesnis užteršimas |
| Bet kuri pavienė MBRT vertė, pateikta nenurodant metodo | Nežinomos tyrimo sąlygos | Jokios kokybės kategorijos ar skaičiaus | Nenurodyta dažiklio sudėtis, santykis, temperatūra, maišymas ir galutinio taško nustatymo taisyklė |
Augimu pagrįsti tyrimai, pavyzdžiui, bakterijų auginimas maitinamosiose terpėse, tebėra būdas nustatyti jų skaičių ir išskirti kultūras. Redukcijos mėgintuvėlis skirtas atrankiniam vertinimui. Pasėlio lėkštelė leidžia identifikuoti ir suskaičiuoti.
Ko testas negali įrodyti apie saugumą
Lėtas rezultatas negali įrodyti, kad patogenų nėra. Kliniškai reikšmingas patogeno kiekis gali mažai prisidėti prie bendro deguonies suvartojimo. Patogenai nustatomi konkretiems mikroorganizmams skirtais metodais, kuriuos dabartinis „Standard Methods“ leidimas nagrinėja atskirai nuo bendrojo atrankinio kokybės vertinimo.
Testas negali patvirtinti pasterizavimo. Pagal „Codex“ pieno higienos gaires terminis apdorojimas tikrinamas šarminės fosfatazės tyrimu arba kitu validuotu metodu. Baltas ar mėlynas mėgintuvėlio turinys nieko nepasako apie partijos apdorojimo laiko ir temperatūros istoriją.
Testas negali patvirtinti maisto saugos. Sauga priklauso nuo patogenų, jau susidariusių toksinų, vaistų likučių, cheminių teršalų, šaltosios grandinės istorijos ir užteršimo po mėginio paėmimo. „Codex“ pieno saugą vertina kaip kontrolės priemonių grandinę, o ne vieną atrankinio tyrimo rezultatą.
Maisto laboratorijos sąlygos nėra tyrimas namuose
Pieno laboratorijoje testas naudojamas priimamo pieno atrankiniam vertinimui, tiekėjų palyginimui laikui bėgant arba redokso mikrobiologijos mokymui su priežiūra. Mėginiai yra atsekami. Reagentai standartizuoti. Temperatūros registruojamos. Atliekos tvarkomos kaip laboratorinės atliekos.
Tiriant namuose viso to nėra. Virtuvėje tūriai matuojami apytiksliai. Internetu parduodamų dažiklių koncentracijos labai skiriasi. Inkubuojama dažnai šiltame kambaryje, o ne kalibruotoje vonelėje. Spalva vis tiek pasikeičia, todėl rezultatas atrodo patikimas, nors nėra nė vienos kontroliuojamos sąlygos, suteikiančios jam prasmę.
Didesnė rizika susijusi su elgesiu. Mėlynas mėgintuvėlis namuose skatina gerti žalią pieną, kurį laboratorija vis tiek siųstų mikroorganizmų skaičiaus pasėlio lėkštelėse, patogenų ir likučių tyrimams. Pieno testas su metileno mėlynuoju sukurtas žalio pieno kokybei vertinti priėmimo metu, o ne pripažinti pieną tinkamu vartoti. Greitesnis atrankinis tyrimas rezazurinu turi tą pačią ribą: spalvos rezultatas gaunamas greičiau, bet atsakymo apie patogenus vis tiek nėra.
Trumpa taisyklė darbui laboratorijoje
Standartizuokite dažiklį, santykį, temperatūrą, maišymą, apšvietimą ir galutinį tašką. Pateikite laiką kartu su metodo pavadinimu ir kokybės kategorija. Vertinkite minutes atsižvelgdami į laikymo istoriją, mikrofloros tipą, likučius ir mėginių ėmimo kokybę. Trumpas laikas rodo aktyvumą, kurį verta ištirti. Ilgas laikas niekada nepatvirtina saugumo.