Metileno mėlynojo kalibravimo kreivės sudarymas: tuštieji mėginiai, intervalas ir tiesiškumas

Du analitikai naudoja tą patį metileno mėlynojo pradinio tirpalo butelį ir kiekvienas sudaro kalibravimo kreivę. Pirmasis gauna tiesę, einančią per koordinačių pradžią, ir užtikrintai matuoja nežinomos koncentracijos mėginius. Antrasis gauna kreivę, kuri viršutinėje dalyje išlinksta, laisvąjį narį, kuris niekaip nepriartėja prie nulio, ir mėginių rezultatus, kintančius skiedžiant. Tas pats dažiklis, tas pats prietaisas, tas pats bangos ilgis. Skirtumas slypi ne įgūdžiuose. Jį lemia tyrimo planas: kas buvo įdėta į tuščiąjį mėginį, kokios koncentracijos pasirinktos ir ar tikrintas intervalas neperžengė srities, kurioje vis dar galioja vienas paprastas modelis.

Kalibravimo kreivė yra susitarimas tarp prietaiso atsako ir koncentracijos, galiojantis tik tomis sąlygomis, kuriomis ji buvo sudaryta. Metileno mėlynojo atveju šis susitarimas turi žinomą silpnąją vietą. Vandenyje dažiklio molekulės jungiasi tarpusavyje, todėl šviesą sugeriančios formos keičiasi priklausomai nuo koncentracijos. Per šį pokytį apimantį intervalą sudaryta kreivė nebus tiesi, ir jokia statistika to nepataisys. Šiame straipsnyje paaiškinama, kaip suplanuoti kalibravimą, kad tiesė turėtų prasmę: pasirinkti tinkamą tuščiąjį mėginį, išlaikyti intervalą monomero vyravimo srityje, tinkamai atlikti pakartojimus ir kreivumą vertinti kaip informaciją, o ne triukšmą.

Pradėkite nuo tuščiojo mėginio, o ne kalibravimo tirpalų

Tuščiasis mėginys apibrėžia nulį, o metileno mėlynojo atveju jame turi būti viskas, išskyrus dažiklį. Ta pati vandens kokybės klasė, tas pats buferinis tirpalas ir pH, tos pačios druskos, ta pati papildomo tirpiklio dalis, ta pati temperatūra. Kalibravimo tirpalus ruoškite tokioje pačioje matricoje. Priežastis cheminė, o ne biurokratinė. Druskos ir tirpiklis keičia monomero, dimero ir aukštesniųjų agregatų pusiausvyrą, todėl pakinta spektras ties matavimo bangos ilgiu. Vien iš vandens sudarytas tuščiasis mėginys negali kompensuoti matricos sukelto dažiklio formų pasiskirstymo pokyčio. Atliekant visuminę metileno mėlynojo spektrų vandenyje analizę, prieinamą per atvirosios prieigos įrašą, natrio chlorido koncentracija buvo keičiama nuo 0 iki 0.15 M būtent todėl, kad joninė jėga keičia pusiausvyrą, o didėjant druskos kiekiui agregacija stiprėjo.

Viena praktinė išvada: niekada nekalibruokite dejonizuotame vandenyje, jei vėliau matuosite mėginius fosfatiniame buferiniame tirpale arba nuotekų filtrate. Kai nėra matricos be analitės, standartinio priedo metodas pačiame mėginyje yra tinkamesnis už išorinę kalibravimo kreivę neatitinkančioje matricoje. Susijusios rekomendacijos, kaip užtikrinti patikimus tyrimus vandeniniuose tirpaluose, pateiktos matricos ir trukdžių aptarime, o bendrieji kiekybinių dažiklių tyrimų principai apžvelgiami tyrimo planavimo apžvalgoje.

Pasirinkite intervalą, kuriame vyrauja viena forma

Kiekybinis nustatymas pagal ilgesnių bangų sugerties juostą ties maždaug 664 nm grindžiamas prielaida, kad didžioji dažiklio dalis yra monomero formos. Gryname vandenyje ši prielaida galioja tik tol, kol tirpalai išlieka praskiesti, maždaug mažų mikromolinių koncentracijų srityje. Paskelbti empiriniai nuolydžiai parodo šią ribą: kalibravimo kreivių, sudarytų neviršijant maždaug 7 mikromolių litre ir naudojant 1 cm kiuvetes, nuolydis yra apie 82,000 M-1 cm-1, o išplėtus kalibravimo intervalą iki maždaug 37 mikromolių litre jis sumažėja iki maždaug 67,100, nes didžiausios koncentracijos kalibravimo tirpaluose jau yra nemažai dimero. Kiekvienas čia minimas koeficientas kartu su atitinkamomis sąlygomis pateiktas metileno mėlynojo spektriniame žinyne, kuriame ir reikėtų lyginti skaičius; šiame straipsnyje jie naudojami tik intervalui nustatyti.

Iš to tiesiogiai išplaukia planavimo taisyklės:

1. Didžiausios koncentracijos kalibravimo tirpalas turi būti pakankamai praskiestas, kad spektro forma išliktų stabili. Kuriant metodą, kiekvienam lygiui nuskenuokite visą regimąjį diapazoną (maždaug nuo 550 iki 750 nm), užuot matavę tik ties vienu bangos ilgiu. Jei normalizuotų spektrų forma keičiasi priklausomai nuo koncentracijos, keičiasi cheminė sistema ir intervalas yra per platus.
2. Stebėkite sugerties ties maždaug 610 nm ir sugerties ties maždaug 665 nm santykį visuose lygiuose. Didėjant koncentracijai augantis santykis reiškia, kad stiprėja dimero juostos petys ir monomero modelis nebetinka. Šis diagnostinis požymis išsamiau paaiškintas agregacijos ir koncentracijos poveikio vadove.
3. Dirbdami su mažomis mikromolinėmis koncentracijomis naudokite 1 cm kiuvetę. Kai nuolydis yra apie 82,000, 5 mikromolių litre koncentracija duoda maždaug 0.41 sugertį, o 10 mikromolių litre – apie 0.82; abi vertės yra patogios daugumai prietaisų.
4. Koncentruotiems pradiniams tirpalams trumpinkite optinį kelią, užuot priėmę gerokai didesnę nei 1 sugertį, tačiau atminkite, kad trumpas kelias išsprendžia fotometrinę, o ne cheminę problemą. Agregacija priklauso nuo koncentracijos, o ne nuo optinio kelio ilgio, todėl koncentruotam pradiniam tirpalui vis tiek reikia atskiro vertinimo, atsižvelgiant į dažiklio formų pasiskirstymą, o ne praskiestų tirpalų monomero kreivės.

Visuminis modelio pritaikymas, kuriuo pagrįsta didelė dalis šio vaizdo, apėmė 224 spektrus nuo 1.1 mikromolio litre iki 3.4 milimolio litre ir parodė, kad tetramero signalas jau aptinkamas esant mažesnei nei 34 mikromolių litre koncentracijai. Šis rezultatas primena: tiesinis intervalas yra siauresnis, nei gali atrodyti, todėl jį patikrinkite, o ne laikykite savaime suprantamu.

Lygiai, pakartojimai ir matavimo tvarka

Trijų taškų kreivė nieko neįrodo. ICH Q2(R2) validavimo gairėse tiesiškumui įvertinti rekomenduojamos bent penkios koncentracijos, o šeši–aštuoni nenuliniai lygiai sudaro įtikinamesnę darbinę kreivę, ypač ties viršutine riba, kur prasideda agregacija. Lygius parinkite taip, kad jie apimtų numatytą mėginių koncentracijų intervalą, ir sutankinkite juos ten, kur kreivumas labiausiai tikėtinas, o ne rinkitės geometrinę seką vien dėl patogumo.

Kiekvieną lygį matuokite dviem arba trimis pakartojimais, paruoštais nepriklausomai, o ne tris kartus nuskaitydami iš vienos kolbos. Nepriklausomi pakartojimai atskleidžia ruošimo paklaidą; pakartotiniai matavimai iš vienos kolbos parodo tik prietaiso triukšmą. 2020 m. visuminiame tyrime kiekvienas tirpalas matuotas tris kartus, ir tai tebėra pagrįstas pradinis pasirinkimas. Matavimo tvarką parinkite atsitiktinai, kad dreifas, adsorbcija ant stiklo ar temperatūros pokyčiai nebūtų palaikyti kreivumu. Kvarcinių kiuvečių tyrime nustatyta, kad per 10 minučių iš 34 mikromolių litre tirpalo adsorbavosi maždaug 3 procentai dažiklio, todėl visos matavimų serijos metu išlaikykite vienodą sąlyčio trukmę, kiuvetę, valymą ir procedūrų seką.

Iliustracinis skaičiavimo pavyzdys (ne matavimo duomenys)

Toliau pateikti skaičiai yra išgalvoti, kad parodytų skaičiavimus. Tai nėra laboratorinių matavimų rezultatai, ir jų negalima cituoti kaip metileno mėlynojo duomenų. Svarbiausia yra su jais susijusių patikrų visuma.

Tarkime, turime šešis kalibravimo tirpalus atitinkančiame buferiniame tirpale, optinio kelio ilgis yra 1 cm, o matuojama ties 665 nm naudojant matricą atitinkantį tuščiąjį mėginį:

Pritaikius tiesinį modelį vidutinės sugerties priklausomybei nuo koncentracijos, gaunamas maždaug 0.0805 sugerties vieneto vienam mikromoliui litre nuolydis ir laisvasis narys, nuo nulio besiskiriantis vos keliais tūkstantaisiais sugerties vieneto. Padalijus nuolydį iš optinio kelio ilgio, gaunamas tariamasis molinis sugerties koeficientas: 0.0805 vienam mikromoliui litre atitinka maždaug 80,500 M-1 cm-1, o tai dera su monomero vyraujamu intervalu vandenyje. Svarbiausia patikra nėra R kvadratas, kuris bet kuriuo atveju atrodys puikiai. Svarbūs yra artimas nuliui laisvasis narys, nekintantis A610/A665 santykis nuo S2 iki S5 ir liekanos, išsibarsčiusios be tendencijos. Santykio padidėjimas ties S6 yra aiškus signalas arba atsisakyti šio lygio, arba pažymėti 7 mikromolius litre kaip preliminarią viršutinę ribą šiam matricos ir prietaiso deriniui.

Nežinomos koncentracijos mėginio, tomis pačiomis sąlygomis davusio 0.245 rodmenį, koncentracija apskaičiuojama tiesiogiai: 0.245 padalijus iš 0.0805 vienam mikromoliui litre gaunama maždaug 3.0 mikromolio litre, dar nepritaikius jokio mėginio skiedimo koeficiento. Rezultatą pateikite kartu su sąlygomis: bangos ilgiu, optinio kelio ilgiu, tuščiojo mėginio matrica, kalibravimo intervalu ir data.

Pildomas kalibravimo darbalapis

Kiekvienai naujai matricai nukopijuokite šį šabloną į laboratorijos žurnalą. Viena matrica, vienas lapas, viena kreivė.

Reagento formos eilutė čia ne be reikalo. Prekyboje metileno mėlynasis gali būti bevandenė druska arba hidratas, pavyzdžiui, trihidratas, o netinkama molinė masė nepastebimai iškraipo kiekvieną nominaliąją koncentraciją. Pradinės medžiagos grynumo ir specifikacijų patikros aptariamos kokybės ir klasės vadove.

Patikrinkite nepriklausomu kontroliniu tirpalu

Kalibravimo kreivė niekada neturėtų pati vertinti savo darbo. Pritaikę modelį, paruoškite vieną kontrolinį tirpalą iš atskirai pasvertos medžiagos paruošto pradinio tirpalo, pasirinkdami koncentraciją netoli priimto intervalo vidurio, ir išmatuokite jį kaip nežinomos koncentracijos mėginį. Sutapimas kelių procentų ribose patvirtina ruošimo grandinę; neatitiktis rodo pradinio tirpalo arba skiedimo, o ne prietaiso problemą. Kontrolinį tirpalą matuokite su kiekviena mėginių partija. Jei jo rodmuo dreifuoja, o kreivė nesikeičia, pirmiau įtarkite darbinius tirpalus arba kiuvetę, o ne mėginius. Šis vienas įprotis padeda aptikti daugumą nepastebimų klaidų: hidrato molinės masės naudojimą bevandenei medžiagai, nesukalibruotą mikropipetę, netinkamos joninės jėgos buferinį tirpalą. Darbalapyje šalia nuolydžio užrašykite kontrolinio tirpalo nustatytos ir nominaliosios koncentracijos santykį, kad vėliau įrašą skaitantis žmogus matytų, jog tiesė buvo patikrinta, o ne tik nubrėžta.

Netiesiškumas kaip diagnostinis požymis

Kai kreivė išlinksta, nuokrypio forma padeda nustatyti priežastį. Žemyn nukreiptas išlinkimas esant didelei sugerčiai ir nepakitusiai spektro formai rodo prietaiso problemą; dažnai tai pašalinė šviesa, dėl kurios didelės sugerties vertės sumažinamos. Kreivumas kartu su stiprėjančiu petimi ties 610 nm rodo cheminę priežastį: dimeras ir aukštesnieji agregatai sugeria kitaip nei monomeras. Tuščiasis mėginys, kurio nepavyksta nustatyti ties nuliu, arba laikui bėgant mažėjantys kalibravimo tirpalų rodmenys rodo indo problemą: adsorbciją ant stiklo ar kiuvečių, ypač jei matavimų serijoje skyrėsi sąlyčio trukmė. O tvarkinga tiesė, einanti per taškus, bet vis tiek duodanti klaidingus mėginių rezultatus, rodo matricos problemą: mėginiai skiriasi nuo kalibravimo tirpalų, todėl kreivę sudarykite iš naujo mėginio matricoje arba pereikite prie standartinio priedo metodo. Visais atvejais nubraižykite liekanų priklausomybę nuo koncentracijos. Atsitiktinė sklaida pagrindžia tiesinį modelį; į šypseną ar susiraukimą panašus išlinkimas jį paneigia patikimiau nei bet kokia R kvadrato ribinė vertė – tai aiškiai pabrėžiama ir validavimo gairėse.

Dirbant su metileno mėlynuoju ši disciplina pasiteisina. Jo monomero sugerties juosta stipri, cheminės savybės gerai ištirtos, o problemų požymiai pasirodo spektre dar prieš iškraipydami skaičius. Kreivę sudarykite siaurame intervale, tinkamai naudokite tuščiąjį mėginį, pakartojimus ruoškite nepriklausomai ir leiskite spektrų formai nulemti intervalą. Gauta tiesė trumpa, bet kiekvienas jos taškas patikimas.

Šiame straipsnyje pateiktuose iliustraciniuose skaičiavimuose naudojami išgalvoti skaičiai metodui parodyti. Išmatuoti etaloniniai koeficientai su visomis sąlygomis pateikti susietame spektriniame žinyne, o pagrindinis agregacijos tyrimas indeksuotas kaip PMID 33251415.