Metileno mėlynasis zebrinių danijų tyrimuose: auginimo priedas ir eksperimentus iškreipiantis veiksnys

Zebrinių danijų ikrų vanduo dažnai būna vos melsvas, ir beveik niekas neužrašo, kodėl. Šis dažiklis yra metileno mėlynasis, dedamas nuo grybelių, o daugumoje protokolų jis laikomas foniniu komponentu. Tačiau fonas čia nėra tinkama sąvoka. Tiksliau būtų vadinti jį nenurodytu eksperimentiniu veiksniu: medžiaga, kurios yra poveikio grupės induose ir nėra kontroliniuose, kuri yra farmakologiškai aktyvi naudojamomis koncentracijomis ir gali pakeisti būtent tuos rodiklius, kuriuos matuoja eksperimentas.

Ši skirtis padeda suprasti viską, kas aptariama toliau. Įprastas naudojimas nuo grybelių auginant yra vienas klausimas. Ar priedas yra neutralus jūsų tyrimo atžvilgiu – jau kitas. Naujausioje literatūroje apie zebrines danijas atsakymas į pirmąjį klausimą ramina, o į antrąjį kelia nerimą.

Ką iš tikrųjų nurodo gairės

Vieno bendro standarto nėra, ir tai yra problemos dalis. Kanados gyvūnų priežiūros tarybos gairės leidžia naudoti 0.5 mg/L, arba 0.00005%, ikrų ir lervų transportavimo tirpale, siekiant sumažinti grybelių augimą. Europos laboratorinių gyvūnų gairėse aprašoma, kad embrionai laikomi terpėje, kurioje dažnai yra tos pačios 0.00005% koncentracijos dažiklio. Cold Spring Harbor E3 receptūroje kaip sudedamoji dalis nurodyta dvigubai didesnė koncentracija – 1 mg/L, arba 0.0001%. Tačiau ryškiai išsiskiria viena spraga: OECD žuvų embrionų toksiškumo tyrimo gairėse nurodomas atkurtos sudėties skiedimo vanduo ir tiriamoji cheminė medžiaga, bet nei 2013 m. versijoje, nei vėlesnėje redakcijoje nėra rekomendacijos naudoti metileno mėlynąjį. Taigi viena laboratorija zebrinių danijų embrionus nuo pirmųjų gyvybės valandų augina mėlyname vandenyje su metileno mėlynuoju, kita reglamentuotą embrionų tyrimą atlieka skaidriame vandenyje, ir abi savo terpę vadina įprasta. Kiekvienas, kas lygina skirtingų laboratorijų rezultatus arba sujungia ankstesnių kontrolinių grupių duomenis, perima šį neatitikimą.

Kad būtų aiškesnis koncentracijų mastas, 0.00005% yra maždaug 1.56 mikromolio litre, o 0.0001% – maždaug 3.13 mikromolio litre. Tai maži skaičiai, todėl kyla pagunda laikyti juos per mažais, kad turėtų reikšmės. Toliau aptariamuose tyrimuose tikrinama būtent ši prielaida, naudojant būtent šias koncentracijas.

Skaitytojai, atėję iš akvariumininkystės, o ne laboratorijų pasaulio, su ta pačia molekule susiduria kitomis aplinkybėmis, aptartomis metileno mėlynojo naudojimo akvariumuose vadove. Chemija ta pati; paaiškinimas, kaip dažiklis perneša elektronus ląstelėse, padeda suprasti, kodėl oksidacijos ir redukcijos reakcijose aktyvus junginys vis pasirodo metabolizmo tyrimuose. Toliau aptariamas būtent metileno mėlynasis zebrinių danijų ikrų vandenyje.

Metabolizmas: poveikio kryptis priklauso nuo stadijos

Informatyviausiame tyrime normaliai besivystančios zebrinės danijos buvo veikiamos dažikliu nuo pirmosios gyvybės dienos iki 5 dienų po apvaisinimo, o oksidacinis metabolizmas buvo matuojamas kiekvienoje stadijoje, kaip aprašyta paskelbtoje embrionų metabolizmo eksperimentų ataskaitoje. Šį dėsningumą verta nusakyti tiksliai, nes poveikio kryptis apsiverčia.

Praėjus 1 dienai po apvaisinimo, dažikliu veiktų embrionų bazinis deguonies suvartojimas padidėjo esant abiem auginimui naudojamoms koncentracijoms. Po 2 dienų lervų paviršiniame sluoksnyje mitochondrijų membranos potencialas buvo padidėjęs esant 0.00005%, 0.0001% ir 0.0003% koncentracijoms. Iki 4–5 dienų, po išsiritimo, poveikio kryptis pasikeitė: oksidacinės energijos sąnaudos sumažėjo tiek tada, kai poveikis buvo nenutrūkstamas nuo apvaisinimo, tiek tada, kai jis buvo trumpalaikis, tik nuo 3 iki 4 dienos. Kartu tiek po 1, tiek po 4 dienų sumažėjo mitochondrijų kvėpavimo kompleksų subvienetų transkriptų kiekis, taip pat transkriptų, susijusių su steroidogeneze ir gliukoneogeneze.

Dar du pastebėjimai papildo vaizdą. Esant didesnei auginimui naudojamai koncentracijai, išsiritimas vyko šiek tiek anksčiau: po 2 dienų dažikliu veikti embrionai buvo pažengę toliau, o iki 3 dienos kontrolinė grupė juos pasivijo. Be to, pati streso ašis, regis, liko nepažeista: kai 5 dienų lervos patyrė stresą dėl vandens sūkuriavimo, kortizolio kiekis visame kūne normaliai padidėjo abiejose grupėse. Taigi tokiomis dozėmis dažiklis nėra bendro pobūdžio vystymosi nuodas ir neslopina visų fiziologinių reakcijų. Jis keičia energijos apykaitą priklausomai nuo stadijos: prieš išsiritimą ją didina, o po išsiritimo mažina.

Elgsena: kodėl du tyrimai nesutampa ir kodėl abu gali būti teisingi

Elgsenos tyrimų literatūra atrodo prieštaringa, kol poveikio schemos nepalyginamos tarpusavyje. Viename vystymosi ir elgsenos saugumo tyrime embrionai nuo maždaug 6 valandų po apvaisinimo buvo veikiami iki 10 mikromolių litre koncentracijomis, tirpalai kasdien keičiami iki 4 dienos, tada 5 ir 6 dienoms lervos perkeltos į terpę be dažiklio, o 6 dieną jų judėjimas tirtas šviesos ir tamsos bandymu. Rezultatas: reikšmingo poveikio mirtingumui, išsiritimui ar morfologijai nebuvo, taip pat nenustatyta poveikio judėjimui. Autoriai pagrįstai rekomendavo 10 mikromolių litre kaip viršutinę ribą jų tyrimo sąlygomis.

Antroji grupė, kurios dalis autorių taip pat dalyvavo metabolizmo tyrime, poveikį taikė taip, kaip jis iš tikrųjų taikomas auginant: dažiklio terpėje buvo nuo 2–3 valandų po apvaisinimo, kasdien dalis terpės buvo keičiama, o elgsena matuota tebevykstant poveikiui arba netrukus po jo. Esant toms pačioms įprastoms koncentracijoms, 24 valandų bandyme lervos judėjo mažiau; rezultatas buvo atkartotas su skirtingomis linijomis ir skirtingose laboratorijose. Elgsenos rodiklių iškraipymo tyrimas susiejo šį poveikį su serotonerginiu tonusu, o tai atitinka žinomą dažiklio gebėjimą slopinti monoaminooksidazę. Iškalbingiausia tai, kad embrionų terpė su metileno mėlynuoju užmaskavo laukiamą judėjimo atsaką į SSRI fluoksetiną. Todėl mėlyname vandenyje atliekamas atrankinis tyrimas gali nepastebėti vaisto poveikio, kurį atskleistų skaidrus vanduo.

Tikro prieštaravimo nėra. Viename bandyme praėjus dviem dienoms po junginio pašalinimo gali nelikti aptinkamo jo poveikio, o kitame jis vis dar gali būti aktyvus, kol yra terpėje. Praktinė išvada tokia: neigiamas rezultatas pagrindžia viršutinę koncentracijos ribą, bet ne teiginį apie neutralumą, o teigiamas rezultatas apibūdina svarbią riziką – aktyvų poveikį matavimo laikotarpiu, taikant būtent tokią schemą, kurią naudoja dauguma laboratorijų.

Redokso dažiklis redokso tyrime

Dar vienai pinklei verta skirti atskirą pastraipą, nes ji iškreipia ne gyvūno būklę, o pačią matavimo sistemą. Alamar Blue energijos sąnaudų tyrimas pats pagrįstas redokso chemija: rezazurinas redukuojamas iki fluorescuojančio rezorufino. Metileno mėlynasis taip pat dalyvauja redokso reakcijose. Kontroliniuose mėginiuose be ląstelių abi auginimui naudojamos koncentracijos po 24 valandų nežymiai, bet reikšmingai sumažino Alamar Blue fluorescenciją. Eksperimentuose su gyvūnais dažikliu veikti embrionai prieš tyrimą bent tris kartus buvo nuplauti terpėje be dažiklio, o biologinis poveikis išsiritusioms lervoms buvo didesnis už trukdžius mėginiuose be ląstelių. Taigi abu teiginiai teisingi: nuplautiems gyvūnams išlieka tikras metabolinis poveikis, o nenuplautas dažiklis papildomai sukuria tiesioginį cheminį artefaktą. Kontrolės turi atskirti šiuos du reiškinius, kitaip nė vienas skaičius nieko nereikš. Bendrosios dažikliais pagrįstų tyrimų rezultatų interpretavimo gairės čia ypač svarbios.

Vystymosi stadijų seka

Originali šio straipsnio medžiaga. Jei nenurodyta kitaip, koncentracijos yra dvi standartinės auginimui naudojamos vertės: 0.00005% ir 0.0001%.

Svarbiausias įsimintinas dėsningumas – ankstyvas metabolinių rodiklių padidėjimas ir vėlesnis sumažėjimas, o elgsenos poveikis pasireiškia poveikio metu ir tampa neaptinkamas po dažiklio pašalinimo tame vieninteliame bandyme, kuriame tai buvo tikrinta.

Kontrolės planavimo sąrašas

Antroji originali medžiaga. Naudokite ją, kai zebrinių danijų protokolai su metileno mėlynuoju tampa eksperimento dalimi.

1. Nurodykite dažiklį kaip reagentą, o ne kaip vandenį. Pateikite koncentraciją ir procentais, ir mikromoliais litre, poveikio pradžią ir pabaigą valandomis arba dienomis po apvaisinimo, terpės keitimo grafiką ir laikotarpį be dažiklio prieš kiekvieną matavimą.
2. Parinkite kontrolines grupes pagal tyrimo klausimą. Tiriamosios cheminės medžiagos tyrimui reikia kontrolinių grupių be dažiklio; auginimo tyrimui reikia grupių be dažiklio ir su juo, registruojant priešgrybelinį rezultatą, nes nė viename iš cituotų tyrimų priešgrybelinis veiksmingumas nebuvo matuojamas.
3. Prieš redokso tyrimus nuplaukite, tada patikrinkite. Bent tris kartus nuplaukite terpėje be dažiklio ir kartu tirkite kontrolinį mėginį be ląstelių, kuriame yra dažiklio ir reagento, nes dažiklis tiesiogiai mažina Alamar Blue signalą.
4. Elgsenos ir monoaminų rodiklius laikykite didelės rizikos sritimi. Judėjimo, krūptelėjimo reakcijos, į nerimą panašios elgsenos, antidepresantų ir MAO inhibitorių tyrimuose matavimo metu reikėtų vengti dažiklio arba įrodyti jo neutralumą konkrečiam rodikliui; vienos–dviejų dienų laikotarpis be dažiklio pašalino vieną poveikį judėjimui, tačiau kitoms tyrimų schemoms tai neįrodyta.
5. Metabolinius ir mitochondrijų rodiklius laikykite didelės rizikos sritimi kiekvienoje stadijoje. Deguonies suvartojimas, energijos sąnaudos, membranos potencialas ir kvėpavimo grandinės transkriptai keičiasi esant auginimui naudojamoms koncentracijoms, prieš išsiritimą ir po jo – priešingomis kryptimis.
6. Neperkelkite neutralumo išvados iš vienos tyrimo schemos į kitą. Neigiamas rezultatas po dažiklio pašalinimo neapima tebesitęsiančio poveikio; neigiamas morfologinis rezultatas neapima metabolizmo ar sąveikos su vaistais; rezultatas, gautas su viena linija, vienoje temperatūroje ar esant vienai tyrimo trukmei, neapima kitų sąlygų.
7. Nurodykite, kuriomis gairėmis vadovavotės ir kokia yra alternatyva. Aiškiai įvardykite CCAC, Europos arba Cold Spring Harbor koncentracijas ir pažymėkite, kur OECD embrionų tyrime dažiklis nenurodytas, kad skaitytojas galėtų suprasti jūsų gyvūnų auginimo kontekstą.

Visa tai nėra argumentas prieš dažiklio naudojimą ikrams išsaugoti gyviems. Tai argumentas prieš tai, kad auginimo sprendimas nepastebimai ir neįvertintas persikeltų į duomenis. Mėlyna spalva inde reiškia molekulę, turinčią farmakologinį poveikį, o labiausiai tikėtina, kad bus iškreipti būtent didelio našumo metaboliniai ir neuroelgsenos atrankiniai tyrimai, kuriems dabar dažnai pasirenkamos jaunos zebrinės danijos. Registruokite jo naudojimą, kontroliuokite jo poveikį, pašalinkite jį prieš matuodami ir patikrinkite tyrimą, kuriame jis galbūt nepastebimai dalyvauja.