Mielių tyrimai metileno mėlynuoju: gyvų ląstelių skaičiavimas ir kvėpavimo trukmės matavimas

Ant laboratorinio stalo stovi du mėgintuvėliai. Abu mėlyni. Viename mikroskopu matomos mėlynos ląstelės reiškia negyvas mieles. Kitame mėgintuvėlyje mėlynos spalvos išnykimas reiškia, kad mielės gyvos ir kvėpuoja. Tas pats dažiklis, priešingos interpretacijos. Supainiojus šiuos du tyrimus, visos išvados apsiverčia.

Būtent šiam skirtumui skirtas visas straipsnis. Metileno mėlynasis yra oksidacijos ir redukcijos dažiklis: oksiduotas jis mėlynas, o redukuotas tampa bespalviu leukometileno mėlynuoju. Gyvybingumo skaičiavimui ši cheminė savybė panaudojama trumpai stebint ląsteles mikroskopu. Kvėpavimo eksperimente ji panaudojama matuojant reakcijos trukmę visame mėginyje. Kiekvienam tyrimui reikia atskiro protokolo, savų kontrolinių priemonių ir kritiško vertinimo.

Gyvybingumo skaičiavimas: trumpas dažymas ir neatidėliotinas vertinimas

Alaus gamyboje taikomas protokolas yra labiausiai standartizuota šio metodo versija. Paruoškite 0.01% w/v metileno mėlynojo tirpalą 2% natrio citrato tirpale, sumaišykite jį santykiu 1:1 su mielių suspensija ir tirkite mišinį po trumpo nustatyto laiko. Skelbiamuose protokoluose šis laikas svyruoja nuo 1 iki 2 minučių Brewing Science Institute vadove iki maždaug 5 minučių mokslinių tyrimų protokoluose, o OIV vyno mikrobiologijos metodas reikalauja mėginį ištirti per 10 minučių. Galutinė dažiklio koncentracija skaičiavimo mišinyje yra apie 0.005%. Užpildykite patobulintą Neubauer skaičiavimo kamerą ir, stebėdami maždaug 400x didinimu, tamsiai mėlynas ląsteles priskirkite negyvybingoms, o nenusidažiusias – gyvybingoms. Pagal OIV metodą šviesiai mėlynos ląstelės laikomos gyvomis; tai jau leidžia numanyti toliau aptariamą subjektyvumo problemą.

Ląstelių koncentracija apskaičiuojama pagal kameros geometriją. Suskaičiavus visą centrinį 1 mm kraštinės kvadratą, ląstelių skaičius viename mL lygus N, padaugintam iš praskiedimo koeficiento ir iš 10^4; N yra tame plote suskaičiuotų ląstelių skaičius, kaip nurodyta ASBC mielių tyrimo metoduose. Gyvybingumas apskaičiuojamas paprasčiau: nenusidažiusių ląstelių skaičius padalijamas iš bendro ląstelių skaičiaus ir padauginamas iš 100. Gyvybingumui įvertinti suskaičiuokite apie 400 ląstelių, vadovaudamiesi FEMS alaus gamybos metodų palyginimo tyrimu ir OIV praktika. Nuosekliai laikykitės vienos ribinių ląstelių skaičiavimo taisyklės, pavyzdžiui, įtraukite ląsteles ant apatinių ir kairiųjų tinklelio linijų, o esančių ant viršutinių ir dešiniųjų neįtraukite.

Pumpurų skaičiavimo taisyklę reikia nustatyti prieš pradedant skaičiuoti. Pagal dažną susitarimą pumpuras skaičiuojamas kaip atskira ląstelė, kai pasiekia maždaug pusę motininės ląstelės dydžio; mažesnis pumpuras skaičiuojamas kartu su motinine ląstele. Kad ir kokią taisyklę pasirinktumėte, taikykite ją kiekvienam kvadratui ir užrašykite skaičiavimo lape, kad kitas žmogus galėtų ją pakartoti.

Skaičiavimo lapas (atsispausdinkite)

Šis skaičiavimo lapas yra originali šiam straipsniui parengta priemonė. Perrašykite jį į užrašų knygelę arba atsispausdinkite po vieną kiekvienam mėginiui.

Gyvybingumas (%) = 100 x nenusidažiusios / (nenusidažiusios + tamsiai mėlynos). Bendras ląstelių skaičius viename mL = N x praskiedimo koeficientas x 10^4, kur N yra nustatytame kameros plote suskaičiuotų ląstelių skaičius. Šalia rezultato užrašykite dažymo trukmę, nes gyvybingumo rodiklis, nenurodžius vertinimo laiko, nėra atkuriamas.

Kodėl gyvybingumo rodikliai kinta

Pirmasis trukdis yra laikas, ir jo poveikis dvejopas. Metaboliškai aktyvios ląstelės redukuoja dažiklį, todėl vertinant per anksti gyvos ląstelės gali dar nebūti baigusios jo redukuoti ir būti klaidingai priskirtos negyvoms. Tačiau ilgas dažiklio poveikis pats savaime yra toksiškas ir sukelia tikrą ląstelių pažeidimą: jos nusidažo mėlynai, todėl susidaro klaidingas pradinio jų negyvybingumo įspūdis. Dėl to laboratoriniame mokomajame protokole nurodoma rezultatą įvertinti per 5 minutes, kaip aprašyta Viskonsino mielių tyrimo mokomajame protokole. Patikima formuluotė yra tokia: vertinimas metileno mėlynuoju priklauso nuo laiko, todėl nustatykite vieną trumpą intervalą ir laikykitės jo visiems serijos mėginiams.

Mažo gyvybingumo mėginiams būdinga antra sisteminė paklaida. Standartizuotame metode perspėjama, kad metileno mėlynasis gali pervertinti tikrąjį gyvybingumą, kai jis mažesnis nei maždaug 80%, nes ląstelės, kurios dar redukuoja dažiklį, nebūtinai išlaiko gebėjimą daugintis. Alaus gamybos literatūroje aprašomas toks pat nepatikimumas, kai gyvybingumas gerokai sumažėjęs. Metileno mėlynuoju gautą rezultatą laikykite greitu apytiksliu įverčiu, o svarbius sprendimus dėl mažo gyvybingumo, pavyzdžiui, ar pakartotinai naudoti kultūrą fermentacijai, pagrįskite kolonijų skaičiavimu lėkštelėse arba papildomu dažymu.

Trečiasis veiksnys – mėginio matricos poveikis. OIV metodas taikomas esant maždaug pH 4.6; jame perspėjama, kad stipriai buferinti žemo pH mėginiai trukdo dažikliui veikti tinkamai, ir patariama netaikyti tyrimo, kai cukraus koncentracija viršija 100 g/L, nes tuomet ląstelės atrodo klaidinamai šviesiai mėlynos. Eksperimentinis dažymo pH palyginimas parodė, kad jautrumas tirtame intervale gerokai keitėsi; tai atitinka nuo pH priklausomo metileno mėlynojo metodo tyrimą. Priemaišos kelia atskirą pavojų: nusidažiusios dalelės nešvariuose misos mėginiuose primena negyvas ląsteles ir didina skirtingų tyrėjų rezultatų skirtumus.

Šis kintamumas išmatuotas, o ne vien pastebėtas pavieniuose atvejuose. Per šešių mėnesių bandymą alaus darykloje, aprašytą FEMS mielių tyrimo metodų palyginime, pakartotinių matavimų metileno mėlynuoju vidutinis standartinis nuokrypis buvo 6.1%, o tėkmės citometrijos su oksonoliu – 0.2%; dviejų tyrėjų to paties mėginio rezultatai skyrėsi iki 13 procentinių punktų. 2023 m. kiekybinis gyvybingumo nustatymo metodų palyginimas parodė, kad fluorescencinė mikroskopija ir tėkmės citometrija yra gerokai preciziškesnės, tačiau metodo veikimas priklauso nuo rūšies ir matricos. Klasikinis Painting ir Kirsop metodo aprašymas (PMID 24430080) išlieka atskaitos tašku, o platesnėje mielių gyvybingumo ir fiziologinio aktyvumo tyrimų apžvalgoje (PMID 25154541) metileno mėlynasis priskiriamas papildomiems, o ne galutiniams tyrimams. Tripano mėlynasis čia nėra savaime geresnis pasirinkimas: jis rodo membranos vientisumo praradimą, o metileno mėlynasis – dažiklio patekimą į ląstelę ir redukcinį aktyvumą, todėl streso paveiktos ląstelės šiais dviem dažikliais gali būti įvertintos skirtingai.

Kvėpavimo eksperimentas: matuokite mėlynos spalvos išnykimo trukmę

Antrajame tyrime mikroskopas visai nenaudojamas. Mielės, gliukozė ir praskiestas metileno mėlynasis supilami į uždarą mėgintuvėlį, o laikmačiu matuojama, per kiek laiko išnyksta mėlyna spalva. Vykstant ląstelių metabolizmui susidaro redukciniai ekvivalentai, paverčiantys mėlyną dažiklį bespalve forma, o ištirpęs deguonis jį vėl oksiduoja. Ląstelėms sumažinus deguonies kiekį, ima vyrauti redukcija ir mėgintuvėlis netenka spalvos. Todėl galutinis taškas atspindi kvėpavimo, dažiklio koncentracijos ir deguonies prieinamumo pusiausvyrą; rezultatą reikia pateikti kaip metileno mėlynojo redukcijos arba spalvos išnykimo trukmę, o ne kaip tiesioginį molekulinio deguonies suvartojimo greitį.

Naudokite gerokai labiau praskiestą dažiklį nei gyvybingumo tyrime, kad trukmė patektų į patogų matuoti intervalą. AQA A lygio privalomųjų praktinių darbų vadove tai gerai standartizuota: 1 g gliukozės 100 mL vandens, pašildyto iki maždaug 30 C, 5 g džiovintų mielių, įdedamų prieš pat naudojimą, ir maždaug 0.001% darbinis dažiklio tirpalas, paruoštas praskiedžiant 0.1 mL 1% pradinio tirpalo iki 100 mL. Sumaišykite 2 mL mielių ir gliukozės suspensijos su 2 mL darbinio dažiklio tirpalo, leiskite mišiniui pasiekti tyrimo temperatūrą, vieną kartą purtykite 10 sekundžių, paleiskite laikmatį ir daugiau nepurtykite. Purtymas vėl įterpia deguonies ir grąžina mėgintuvėliui mėlyną spalvą – tai didžiausias procedūros sukeltas artefaktas. AQA nurodo, kad esant 35 C paruoštas mišinys paprastai turėtų netekti spalvos per maždaug 5 minutes; bandymų vidurkiai buvo 275 s esant 20 C, 128 s esant 35 C ir 145 s esant 45 C. Tai vienos eksperimentinės sistemos pavyzdžiai, o ne universalūs etalonai. Kiekybinį ryšį tarp redukcijos greičio ir metaboliškai aktyvių mielių kontroliuojamomis sąlygomis pagrindžia specialūs redukcijos tyrimai, įskaitant darbą, indeksuotą kaip PMID 25773544, ir mechanizmo tyrimą žurnale Yeast (2014).

Kitimo laike demonstracija (originali medžiaga)

Toliau pateikta lentelė yra originali šiam straipsniui parengta demonstracija pagal pirmiau aprašytą AQA tipo eksperimentinę sistemą: 2 mL mielių ir gliukozės mišinio bei 2 mL maždaug 0.001% darbinio dažiklio tirpalo, vienas 10 sekundžių purtymas, tada ramus inkubavimas. Įrašai yra pavyzdiniai rodmenys tokiu formatu, kokiu juos turėtų užrašyti mokinių grupė; greičio indeksas apibrėžiamas kaip 1, padalytas iš spalvos išnykimo trukmės sekundėmis. Atlikite bandymą su tokiais pačiais mėgintuvėliais ir pakeiskite šiuos įrašus išmatuotomis vertėmis.

Nubraižykite A, B ir C mėgintuvėlių greičio indekso priklausomybę nuo temperatūros. Kreivė kyla, tada išsilygina arba leidžiasi – tai numatomas fermentų veiklos nulemtas pobūdis, o ne tiesė. D, E ir F mėgintuvėliai nėra šios kreivės duomenų taškai. Tai kontroliniai mėginiai, leidžiantys kreivę interpretuoti.

Kontrolinės priemonės, suteikiančios prasmę kiekvienam tyrimui

Kiekvienam kvėpavimo tyrimui reikia trijų papildomų mėginių. Virintos arba žuvusios mielės su gliukoze ir dažikliu turėtų likti mėlynos, parodydamos, kad greita redukcija priklauso nuo gyvų ląstelių metabolizmo. Gyvos mielės su dažikliu, bet be pridėtos gliukozės, yra substrato kontrolinis mėginys, tačiau ir jame tikėkitės lėto spalvos išnykimo, nes mielės naudoja vidines atsargas. Gliukozė su dažikliu, bet be mielių, yra cheminis tuščiasis mėginys; jis būtinas, nes šarminėje terpėje gliukozė gali redukuoti metileno mėlynąjį net ir nesant ląstelių.

Gyvybingumo skaičiavimui reikia kitokios kontrolės – procedūros pastovumo. Tas pats pradinis dažiklio tirpalas, tas pats maišymo santykis, ta pati dažymo trukmė, tas pats kameros plotas, tos pačios pumpurų ir ribinių ląstelių skaičiavimo taisyklės; jei įmanoma, skaičiuojama nežinant mėginio tapatybės. Kai dviejų tyrėjų rezultatai skiriasi dešimčia procentinių punktų, skaičiavimo lapas paprastai atskleidžia priežastį: skirtingą vertinimo laiką, skirtingą mėlynos spalvos slenkstį arba skirtingas pumpurų skaičiavimo taisykles. Dažytų ląstelių paruošimo ir stebėjimo būdai siejasi su paprastojo bakterijų dažymo metodais, o platesnė apžvalga, ką dažiklis išryškina įvairiuose mėginiuose, pateikta mikroskopinio dažymo atlase. Kiekybinio bet kokio mėlynos spalvos intensyvumo vertinimo fiziką paaiškina sugerties žinynas su nurodytomis sąlygomis: kiekvienas koeficientas turi būti pateikiamas kartu su tirpiklio, pH ir koncentracijos sąlygomis.

Tyrimą rinkitės pagal klausimą. Kiek ląstelių šiuo metu yra gyvos – tai skaičiavimo klausimas, į kurį atsakoma mikroskopu ir skaičiavimo lapu. Kaip aktyviai ši kultūra kvėpuoja – tai kinetikos klausimas, į kurį atsakoma chronometru ir kontroliuojamais mėgintuvėliais. Metileno mėlynasis tinka abiem, bet niekada tame pačiame mėgintuvėlyje tuo pačiu metu.