Metileno mėlynasis ir progerija: ląstelinio senėjimo modelio pamokos

Vienos raidės pokytis viename gene verčia vaikus senti bauginančiu greičiu. Plaukų slinkimas, sustingę sąnariai, susiaurėjusios arterijos ir tikėtina gyvenimo trukmė, siekianti vos paauglystę. Ši liga vadinama Hutchinsono–Gilfordo progerijos sindromu, o jos tyrimai daugelį metų buvo sutelkti į branduolį, kuriame žalą daro mutantinis baltymas. 2016 metais Merilando universitete atliktame tyrime iškeltas kitoks klausimas: kaip šiose ląstelėse atrodo mitochondrijos? Atsakymas susiejo du ląstelės skyrius, o šimtmetį žinomas mėlynas dažiklis paveikė juos abu.

Tai Xiong ir kolegų tyrimas, paskelbtas žurnale „Aging Cell“ 2016 metais. Jis atliktas tik su kultivuojamomis ląstelėmis. Šis faktas lemia, kaip reikia suprasti viską, kas aptariama toliau. Rezultatai yra tikri ir konkretūs. Jų atotrūkis nuo bet kokio gydymo taip pat aiškiai apibrėžtas.

Modelis: viena mutacija, vienas prilipęs baltymas

Progerija prasideda nuo C pakeitimo į T LMNA geno 1824 pozicijoje. Šis pokytis nepakeičia aminorūgšties. Jis suaktyvina paslėptą splaisingo vietą, todėl lamino A baltymas netenka 50 aminorūgščių. Sutrumpintas produktas, vadinamas progerinu, praranda skėlimo vietą, kuri įprastai leistų ląstelei pašalinti jo farnezilo inkarą. Todėl progerinas lieka nuolat farnezilintas ir prisitvirtinęs prie vidinės branduolio membranos, nors normalus laminas A prie jos prisijungia ir nuo jos atsiskiria.

Pasekmės branduoliui gerai dokumentuotos ir matomos pro mikroskopą. Užuot išlaikę lygią ovalią formą, branduoliai formuoja išsipūtimus ir raukšlėjasi. Heterochromatino — tankiai supakuotos, genų raiškos požiūriu neaktyvios DNR, kuri įprastai išsidėsčiusi palei branduolio kraštą, — sluoksnis suplonėja. Pakinta tūkstančių genų raiška. Įsivaizduokite branduolio laminą kaip atraminį karkasą už tapetų: kai viena karkaso dalis privirinama netinkamoje vietoje, siena išsipučia, o tapetų raštas išsikraipo visame kambaryje.

Tyrime naudoti progerija sergančių pacientų odos fibroblastai ir kontrolinės ląstelės, kurių persėjimų skaičius buvo toks pats, taip pat antra ląstelių linija, modifikuota taip, kad normalūs fibroblastai tiesiogiai gamintų progeriną. Modifikuotose ląstelėse atsirado tie patys defektai, todėl jų priežastį galima sieti su progerinu, o ne su pacientų ligos istorija ar kultivavimo trukme. Defektų sunkumas priklausė nuo progerino kiekio: daugiau progerino gaminusioje linijoje visi defektai buvo ryškesni.

Kaip atrodė mitochondrijos

Sveikų fibroblastų mitochondrijos sudaro šakotą tinklą aplink branduolį — ilgus vamzdelius, judančius citoskeleto takais. Progerijos ląstelių linijose šio tinklo nebeliko. Didesnė mitochondrijų dalis buvo fragmentuota, daugelis jų buvo išbrinkusios, o elektroninė mikroskopija parodė maždaug dvigubai didesnį smarkiai pažeistų organelių kiekį. Laiko intervalais fiksuoti vaizdai parodė, kad jos judėjo trumpesniais atstumais ir lėčiau nei kontrolinėse ląstelėse.

Funkcijos pokyčiai atitiko formos pokyčius. Padidėjo mitochondrijų superoksido ir bendras ląstelės oksidantų lygis. Daugiau ląstelių nustatytas sutrikęs membranos potencialas. Sumažėjo ATP gamyba. Atskirai vertinant, nė vienas iš šių pokyčių nestebina, nes pažeistos mitochondrijos išskiria reaktyviąsias deguonies formas ir gamina mažiau energijos. Nauja buvo siūloma priežastis. PGC-1alpha — transkripcijos koaktyvatoriaus, skatinančio mitochondrijų biogenezę per toliau veikiančius veiksnius, tokius kaip NRF1, TFAM, ir susiliejimo bei dalijimosi reguliatorius MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 ir DRP1, — raiška progerijos ląstelėse mRNR lygmeniu buvo sumažėjusi maždaug aštuonis kartus; atitinkamai sumažėjo ir baltymo kiekis. Atrodė, kad progerinas slopina pagrindinį mitochondrijų susidarymo ir palaikymo jungiklį. Šis ryšys tarp branduolio laminos pažeidimo ir energijos apykaitos yra platesnio mitochondrijų energijos gamybos paaiškinimo dalis, o tos pačios pusiausvyros oksidantų pusė aptariama nagrinėjant oksidacinį stresą ir reaktyviųjų deguonies formų kontrolę.

Ką pakeitė metileno mėlynasis

Tyrėjai kelias savaites nepertraukiamai veikė ląsteles maža, 100 nanomolių litre metileno mėlynojo koncentracija. Ląstelių kultūros požiūriu tai ilgas, švelnus poveikis, o ne trumpas vaisto impulsas. Metileno mėlynasis cikliškai pereina iš oksiduotos formos į redukuotą ir atgal bei gali pernešti elektronus mitochondrijose. Todėl jis apibūdinamas kaip mitochondrijas veikiantis redokso junginys, o ne įprastas antioksidantas, kuris sunaudojamas neutralizuodamas vieną oksidantą.

Mitochondrijos reagavo tiek normaliose, tiek progerijos ląstelėse. ATP kiekis padidėjo, oksidantų lygis sumažėjo, o smarkiai pažeistų mitochondrijų dalis susitraukė. PGC-1alpha raiška iš dalies atsikūrė, kaip ir kai kurių jo reguliuojamų taikinių raiška. Iki šio taško tai bendras mitochondrijų funkcijos palaikymo poveikis, o ne progerijai būdingas reiškinys.

Netikėti buvo branduolio rezultatai, būdingi tik ligos paveiktoms ląstelėms. Kiekybinė formos analizė parodė, kad branduolio išsipūtimų sumažėjo. Bendras laminų A ir C kiekis padidėjo. Ryškiausias pokytis buvo progerino persiskirstymas: nepaveiktose progerijos ląstelėse tik apie 30 procentų progerino buvo tirpiojoje nukleoplazmos frakcijoje, o likusi dalis buvo prisitvirtinusi prie membranos. Po poveikio tirpioji dalis padidėjo iki maždaug 65 procentų ir priartėjo prie normaliam laminui būdingo pasiskirstymo. Atsiskyręs nuo membranos, progerinas mažiau tempia kartu esančius baltymus, o laminų A ir C tirpiosios frakcijos taip pat atsikūrė.

Po šio atsiskyrimo pagerėjo du branduolio fenotipiniai požymiai. Aplink branduolio pakraštį esantis heterochromatinas, tirtas elektronine mikroskopija ir dažant heterochromatino baltymą HP1-alpha, akivaizdžiai atsikūrė. Be to, RNR sekoskaita parodė, kad transkriptomas artėja prie normalios būklės: nepaveiktos progerijos ląstelės nuo kontrolinių skyrėsi daugiau kaip 3,200 genų raiška, o paveiktos progerijos ląstelės — maždaug 1,670 genų raiška. Normaliose ląstelėse tas pats poveikis pakeitė tik kelių dešimčių genų raišką. Tai leidžia manyti, kad poveikis branduoliui susijęs su progerinu, o ne su bendru transkripcijos sukrėtimu. Principas, kad ląstelių ir gyvūnų modeliai atsako į siauresnius klausimus, nei leidžia manyti antraštės, paaiškinamas straipsnyje kaip skaityti metileno mėlynojo tyrimus.

Kodėl tai nėra gydymas

Keturios ribos neleidžia šio tyrimo rezultatų perkelti už laboratorijos ribų.

Pirma, viskas vyko laboratoriniuose induose. Kultivuojami fibroblastai neturi kraujotakos, imuninės aplinkos, audinių architektūros ir viso organizmo farmakologinių sąlygų, nuo kurių priklauso, ar junginys apskritai pasieks taikinį. Šiame tyrime junginys nebuvo skirtas nė vienam gyvūnui ir juo nebuvo gydytas nė vienas pacientas.

Antra, progerijos fibroblastai yra vieno tipo ląstelių modelis. Mirtinas šios ligos poveikis daugiausia susijęs su arterijomis, kaulais ir riebaliniu audiniu, o tyrime patikrinti tik fibroblastai ir vienas lygiųjų raumenų ląstelių preparatas. Kiti audiniai gali reaguoti kitaip.

Trečia, branduolio būklė pagerėjo po kelias savaites trukusio nepertraukiamo nanomolinės koncentracijos poveikio kultivavimo terpėje. Koncentracijos laboratoriniame inde nėra dozės, o tyrime niekas nepaverčia 100 nanomolių litre koncentracijos terpėje į žmogui skirtą vartojimo schemą. Kitose medicinos srityse metileno mėlynasis turi savą priklausomybę tarp dozės ir atsako bei saugumo profilį, o šis tyrimas nesuteikia jokio pagrindo jį vartoti namuose. Bendras saugumo kontekstas pateikiamas straipsnyje metileno mėlynojo saugumas ir šalutinis poveikis.

Ketvirta, progerija nėra normalus senėjimas. Tai reta, vienos mutacijos sukelta liga, kurios metu branduolio karkasas pažeidžiamas konkrečiu būdu. Junginys, sumažinantis būtent šį pažeidimą kultivuojamose ląstelėse, mažai ką pasako apie žmonių, neturinčių šios mutacijos, senėjimą. Ląstelių fenotipas leidžia pažvelgti į branduolio ir mitochondrijų tarpusavio sąveiką, bet nėra ilgaamžiškumo tyrimo rezultatas.

Todėl pagrįsta santrauka turi būti sąlyginė. Progerijos fibroblastuose progerinas slopina PGC-1alpha, o mitochondrijos tampa fragmentuotos, lėtai judančios, sukaupia daug oksidantų ir gamina mažai energijos. Mažos koncentracijos metileno mėlynasis atkūrė mitochondrijų rodiklius visose ląstelėse, o ligos paveiktose ląstelėse papildomai atpalaidavo progeriną nuo branduolio membranos; iš dalies atsikūrė branduolio forma, heterochromatinas ir genų raiška. Dėl šio dvigubo poveikio apie tyrimą verta žinoti. Tačiau tai nepaverčia metileno mėlynojo progerijos ar senėjimo gydymo priemone.