Metileno mėlynasis G6PD laboratoriniuose tyrimuose: ką iš tikrųjų daro šis dažiklis

Studentas po inkubacijos stebi du mėgintuvėlius. Viename spalva pasikeitė taip, kaip tikėtasi. Kitame – ne. Studentas padaro išvadą, kad antrajam pacientui trūksta gliukozės-6-fosfato dehidrogenazės. Ši išvada gali būti teisinga, tačiau taip samprotaujant praleidžiama tyrimo veikimo esmė. Mėgintuvėlyje fermentas tiesiogiai nematuojamas. Matuojama tai, ką fermentas pagamina, o metileno mėlynasis pasitelkiamas kaip tarpininkas.

Supratus šį netiesioginį ryšį, procedūra, kontroliniai mėginiai ir ilgas klaidingų rezultatų priežasčių sąrašas nebeatrodo savavališki.

Trumpas atsakymas

G6PD tyrimuose metileno mėlynasis yra redokso indikatorius. Fermentas G6PD gamina NADPH, o nuo NADPH priklausomos sistemos redukuoja mėlyną metileno mėlynąjį iki bespalvės leukoformos arba naudoja jį elektronams pernešti. Esant normaliam fermento aktyvumui, redukcija vyksta efektyviai. Kai aktyvumas nepakankamas, redukcija lėta arba nevisiška. Tai ir yra visas tyrimo signalas.

Dviem istoriniams metodams naudojamas tas pats dažiklis, tačiau skiriasi galutinis vertinimo rodiklis. Atskirai juos nagrinėjant, dauguma neaiškumų išnyksta.

Du tyrimai, vienas dažiklis, skirtingi galutiniai rodikliai

Pirmasis – tiesioginis metileno mėlynojo redukcijos tyrimas, kurį aprašė Sass ir kolegos, o vėliau įvertino Gibbs. Čia galutinis rodiklis yra pats dažiklis: oksiduotas mėlynas metileno mėlynasis redukuojamas iki bespalvio leukometileno mėlynojo, o šio pokyčio greitis atspindi gebėjimą gaminti NADPH. Pirminis straipsnis apie atrankinį tyrimą indeksuotas PubMed duomenų bazėje kaip Sass ir kt. (1966) publikacija.

Antrasis – Brewerio methemoglobino redukcijos tyrimas. Pirmiausia natrio nitritas oksiduoja hemoglobiną iki rudo methemoglobino. Tada metileno mėlynasis veikia kaip elektronų pernašos tarpininkas: redukuotas metileno mėlynasis perduoda redukcinius ekvivalentus methemoglobinui ir paverčia jį atgal į raudoną hemoglobiną. Taigi matomas galutinis rodiklis yra rudos ir raudonos, o ne mėlynos ir bespalvės būsenos skirtumas. Pradinis metodas paskelbtas Pasaulio sveikatos organizacijos biuletenyje (Brewer ir kt., 1960).

Brewerio tyrimą vadinti dažiklio spalvos išnykimo tyrimu chemiškai netikslu. Dažiklis cikliškai oksiduojasi ir redukuojasi, o spalvą keičia hemoglobinas. Toliau pateiktoje schemoje parodyti abu reakcijų keliai.

Pagrindinė reakcija

G6PD katalizuoja pirmąjį pentozių fosfato kelio oksidacinį etapą:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Subrendę eritrocitai labai priklauso nuo šio NADPH gamybos kelio, kaip apžvelgiama Luzzatto ir kolegų publikacijoje žurnale „Blood“ (2020). NADPH palaiko redukuotą glutationo būseną ir apsaugo ląstelę nuo oksidacinės pažaidos. Metileno mėlynasis į šią sistemą įsitraukia kaip elektronų akceptorius. Pakankamas G6PD aktyvumas užtikrina pakankamą NADPH kiekį, o šis – efektyvią redukciją. Mažas G6PD aktyvumas nutraukia grandinę jau ties pirmąja grandimi.

Įsivaizduokite dažiklį kaip degalų lygio matuoklį, o ne variklį. Jis parodo NADPH prieinamumą. Bet kuris kitas veiksnys, keičiantis šį prieinamumą arba rodmens nuskaitymą, gali pakeisti rodmenį net ir nesant jokio geno pokyčio.

Kaip atliekama Brewerio tipo procedūra

Per dešimtmečius reagentų sudėtis keitėsi, todėl mokomojo aprašymo negalima laikyti klinikiniu protokolu. Kiekviena laboratorija vadovaujasi savo validuota standartine veiklos procedūra. Atsižvelgiant į šią išlygą, klasikinis tyrimas mėgintuvėliuose atliekamas taip; trijų mėgintuvėlių ir 3 valandų inkubacijos variantas aprašytas šioje publikacijoje:

1. Paciento mėgintuvėlis: visas kraujas su gliukoze, natrio nitritu ir metileno mėlynuoju. Nitritas sudaro methemoglobiną, gliukozė palaiko eritrocitų metabolizmą, o dažiklis užtikrina nuo NADPH priklausomą elektronų pernašą.
2. Oksiduotas kontrolinis mėginys: kraujas su nitritu ir gliukoze, bet be metileno mėlynojo. Jis parodo rudą methemoglobino spalvą, atitinkančią trūkumo rezultatą.
3. Hemoglobino kontrolinis mėginys: kraujas su vandeniu. Jis parodo raudoną hemoglobino spalvą, atitinkančią normalų rezultatą.
4. Inkubuokite visus mėgintuvėlius maždaug 37 C temperatūroje, paprastai 3 valandas, švelniai maišydami.
5. Praskieskite nedidelę kiekvieno mėgintuvėlio mėginio dalį distiliuotu vandeniu, kad ląstelės lizuotųsi ir būtų galima aiškiai palyginti spalvas.
6. Palyginkite paciento mėgintuvėlį su abiem kontroliniais mėginiais. Spalvos grįžimas link raudonos rodo didelį redukcinį pajėgumą. Išliekanti rusva spalva leidžia įtarti ryškų trūkumą.

Viename istoriniame variante buvo naudojama apie 1 mL kraujo ir reagentai, kurių koncentracijos buvo maždaug 180 mM natrio nitrito, 280 mM dekstrozės ir 0.4 mM metileno mėlynojo. Šiuos skaičius laikykite literatūros pavyzdžiu, o ne universalia specifikacija.

Rezultato vertinimas

Kokybinis atrankinis tyrimas geriausiai atskiria rezultatus ties maždaug 30–40 procentų normalaus aktyvumo riba, kaip aptariama šioje žurnalo „Malaria Journal“ apžvalgoje apie G6PD nustatymo spragas. Taigi normalus atrankinio tyrimo rezultatas reiškia, kad tyrimas nenustatė ryškaus trūkumo. Jis nepatvirtina visiškai normalaus aktyvumo.

Kodėl atrankiniai tyrimai gali klaidinti

Retikulocitozė po hemolizės yra klasikinė klaidingai normalaus rezultato priežastis. Jaunuose eritrocituose ir retikulocituose G6PD yra daugiau nei senose ląstelėse. Ūmaus hemolizės epizodo metu seniausios ląstelės, kuriose trūkumas didžiausias, jau gali būti suirusios, todėl lieka jaunų ląstelių populiacija, kurios aktyvumas tyrime atrodo normalus. Tas pats biologinis reiškinys klaidina ir kiekybinius tyrimus, ne tik atrankinius tyrimus su dažikliu.

Neseniai atlikta transfuzija užmaskuoja trūkumą, nes donoro eritrocitai į mėginį įneša savo fermento. „Mayo Clinic Laboratories“ nurodo transfuziją kaip vieną iš nepatikimų fermento tyrimo rezultatų priežasčių, kartu su retikulocitoze ir leukocitų interferencija.

Heterozigotinės moterys yra sudėtingiausias atvejis. Dėl atsitiktinės X chromosomos inaktyvacijos susidaro normalių eritrocitų ir eritrocitų, kuriuose fermento trūksta, mišinys, o bendras aktyvumas gali svyruoti nuo labai sumažėjusio iki tariamai normalaus. Kokybiniai atrankiniai tyrimai dažnai neaptinka tarpinių fenotipų. PSO dokumentuose apie G6PD tyrimus šis ribotumas aptariamas išsamiai.

Mėginio amžius, laikymo temperatūra, vizualaus galutinio rodiklio vertinimo subjektyvumas, hematokritas ir reagentų kokybė prie šių biologinių veiksnių prideda analitinį triukšmą.

Atrankinis tyrimas nėra diagnozė

Jei atrankinis tyrimas rodo trūkumą, tarpinį rezultatą arba neatitinka klinikinio vaizdo, reikia kiekybinio G6PD fermento aktyvumo tyrimo. PSO pamatiniu metodu laiko kiekybinę spektrofotometriją kontroliuojamoje temperatūroje. Atliekant šį tyrimą, į eritrocitų hemolizatą pridedama gliukozės-6-fosfato ir NADP+, o susidarantis NADPH stebimas pagal didėjančią absorbciją ties 340 nm. Pokyčio greitis proporcingas fermento aktyvumui, kuris paprastai perskaičiuojamas pagal hemoglobino kiekį ir išreiškiamas vienetais gramui. Dabartinė klinikinių laboratorijų praktika apibendrinta Mayo tyrimų katalogo įraše apie G6PD aktyvumą.

Rezultatai interpretuojami pagal laboratorijos validuotą pamatinių verčių intervalą, dažnai išreiškiamą populiacijos normalaus aktyvumo atžvilgiu. Trūkumas paprastai aptariamas ties maždaug 30 procentų slenksčiu, o tarpinis aktyvumas – virš jo. Ši diagnostinė sistema išdėstyta PSO tiksliniuose G6PD tyrimų produktų profiliuose (2022). Jei dėl nesenos hemolizės ar transfuzijos fenotipo nustatymas nepatikimas, tyrimą reikia pakartoti, kai eritrocitų populiacija vėl nusistovi; molekuliniai tyrimai gali suteikti papildomos informacijos, tačiau nepakeičia fermento aktyvumo matavimo.

Riba, kurią verta išlaikyti

Šiuose tyrimuose metileno mėlynasis yra ex vivo laboratorinis reagentas. Tai atskiras klausimas nuo metileno mėlynojo skyrimo pacientui saugumo, kuris aptariamas informacijoje apie metileno mėlynojo kontraindikacijas. Juos sieja biochemija, nes vaisto veikimas taip pat priklauso nuo NADPH priklausomos redukcijos, tačiau dažiklis mėgintuvėlyje nėra dozė kraujotakoje. Apie tai, kaip dažiklis veikia kaip dažymo priemonė kitomis sąlygomis, skaitykite metileno mėlynojo dažymo principus, o apie cheminę grupę, kuriai jis priklauso, – apie redokso dažiklius laboratorijoje.

Atrankiniu tyrimu klausiama, ar redukcinis pajėgumas atrodo išlikęs. Patvirtinamuoju tyrimu klausiama, kiek fermento iš tikrųjų yra. Dažiklis gerai padeda atsakyti į pirmąjį klausimą, jei tik niekas nesitiki, kad jis atsakys ir į antrąjį.