Metileno mėlynasis prieš bioplėveles: ką matuoja šviesa aktyvinami laboratoriniai tyrimai

Bioplėvelė nėra skystyje plūduriuojančių ląstelių sankaupa. Tai struktūra: prie paviršiaus prisitvirtinusios ląstelės, įterptos į pačių sukurtą polisacharidų, baltymų ir neląstelinės DNR matricą, kurioje nuo išorės į vidų kinta deguonies ir maistinių medžiagų koncentracija. Dėl šios struktūros junginys, per kelias minutes sunaikinantis suspensijoje esančias bakterijas, gali nesuveikti prieš tuos pačius organizmus, užaugintus kaip bioplėvelė. Bet kurį teiginį apie metileno mėlynąjį ir bioplėveles reikia vertinti atsižvelgiant į šią struktūrą, nes matrica lemia, kiek dažiklio pasiekia ląsteles ir kiek šviesos pasiekia dažiklį.

Ši apžvalga apima tiksliai tris šaltinius. Vienas pateikia bendrą kontekstą. Kiti du yra laboratoriniai eksperimentai. Visas vertinimo metodas grindžiamas šių vaidmenų atskyrimu: taip išvengiama dažniausios šios temos klaidos – laboratoriniame inde gauto rezultato citavimo taip, tarsi tai būtų žmogaus infekcijos gydymo įrodymas.

Kontekstinis šaltinis nagrinėja chemiją, o ne sunaikinimą

Seniausias iš šių trijų šaltinių yra 2005 m. paskelbta naratyvinė fenotiazino katijonų grupės fotosensibilizatorių kūrimo apžvalga. Joje aprašomas metileno mėlynojo kelias nuo 19 amžiaus dažiklio iki pradinio junginio vėžio fotodinaminei terapijai, o vėliau – fotodinaminei antimikrobinei chemoterapijai. Jos indėlis – struktūros ir aktyvumo sąsajų paaiškinimas: chromoforo metilinimas didina lipofiliškumą, singletinio deguonies išeigą ir fotobaktericidinį aktyvumą, kartu lėtindamas redukciją į mažiau aktyvią leukomo formą. Apžvalgoje taip pat aiškiai įvardijama šios srities problema. Daugumoje publikacijų naudoti standartiniai komerciniai dažikliai, o darinių kūrimui skirta palyginti mažai dėmesio.

Šią apžvalgą naudokite savo supratimo modeliui apie veikimo mechanizmą: šviesa sužadina dažiklį, tripletinė būsena sąveikauja su deguonimi per II tipo energijos perdavimą, susidarant singletiniam deguoniui, arba per I tipo elektronų perdavimą, susidarant radikalams. Būtent dėl šio daugiaveiksnio poveikio įprasti atsparumo mechanizmai menkai apsaugo nuo fotodinaminio sunaikinimo. Necituokite jos kaip logaritminio sumažėjimo įrodymo. Ji tokio sumažėjimo nematavo. Platesnė šio mechanizmo fotochemija išdėstyta fotodinaminės terapijos įrodymų rinkinyje, o bangos ilgio dėsningumai, lemiantys, ar konkreti lempa gali jį sukelti, aptariami straipsnyje kaip metileno mėlynasis sugeria raudoną šviesą.

Du bioplėvelių eksperimentai, du skirtingi rezultatų vertinimo pagrindai

Abiejuose eksperimentiniuose straipsniuose tiriamas metileno mėlynojo fotodinaminis poveikis burnos bioplėvelėms naudojant 660 nm šviesą, tačiau beveik visa kita skiriasi. Skirtingos bendrijos, skirtingas amžius, skirtingos dažiklio formuluotės, skirtingos šviesos dozės ir, svarbiausia, skirtingi vertinamieji rodikliai. Šis skirtumas yra pagrindinė šio straipsnio mintis ir toliau pateiktos originalios palyginimo lentelės esmė.

Pirmasis yra 2024 m. paskelbtas brandžios daugiarūšės podanteninės bioplėvelės tyrimas in vitro. Trisdešimt trys rūšys kartu augintos ant polistireno kaištelių „Calgary Biofilm Device“ įrenginyje, maitinamos anaerobinėmis sąlygomis; po 72 valandų terpė pakeista, o auginimas tęstas iki nominalių 7 dienų. Poveikiui naudotas laisvas 0.01 procento metileno mėlynasis ir 660 nm raudonas LED, kurio apšvitos intensyvumas buvo maždaug 330 mW vienam kvadratiniam cm, 5 minutes iš 2 mm atstumo. Padauginus gaunama maždaug 99 J vienam kvadratiniam cm. Tyrimas suplanuotas kaip aiškus faktorinis eksperimentas su keturiomis grupėmis: nepaveikta kontrolinė grupė, dažiklis be šviesos, šviesa be dažiklio ir dažiklis su šviesa.

Antrasis yra 2021 m. paskelbtas ankstyvųjų burnos kolonizatorių bioplėvelės tyrimas in vitro. Keturios Streptococcus rūšys kartu augintos 24 valandas 96 šulinėlių plokštelėse su 1 procentu sacharozės. Fotosensibilizatorius buvo su beta ciklodekstrino nanodalelėmis susietas metileno mėlynasis, kurio koncentracija – 4.65 mikromolio litre. Ši pernašos formuluotė skirta dažikliui pernešti pro bioplėvelės barjerus. Abu šviesos šaltiniai skleidė raudoną 660 nm šviesą, o ekspozicijos truko 90 sekundžių, tačiau dozės labai skyrėsi: lazerio grupėje – 320 J vienam kvadratiniam cm, LED grupėje – 8.1 J vienam kvadratiniam cm. Kontrolinės grupės apėmė dažiklį be šviesos, vien lazerį, vien LED, fiziologinį tirpalą kaip neigiamą kontrolę ir 0.2 procento chlorheksidiną kaip antimikrobinio poveikio palyginimo etaloną.

7 dienų, 33 rūšių anaerobinė bendrija ir 24 valandų, 4 rūšių ankstyvųjų kolonizatorių bioplėvelė yra skirtingos matavimo sistemos. Toliau pateiktų skaičių negalima suvidurkinti.

Ką iš tikrųjų matavo kiekvienas tyrimas

Brandžios bioplėvelės tyrime vertinamieji rodikliai buvo metabolinis aktyvumas, nustatytas pagal TTC redukciją matuojant ties 485 nm, ir bakterijų skaičius, nustatytas šachmatinės matricos DNR–DNR hibridizacija su 33 rūšims skirtais zondais; aptikimo riba buvo apie 10,000 ląstelių. Gyvybingų mikroorganizmų skaičius sėjant į terpes nebuvo nustatytas, biomasė kristaliniu violetiniu nevertinta, gyvų ir negyvų ląstelių vaizdinimas neatliktas, pakartotinis augimas nestebėtas. Vien LED sumažino metabolinį aktyvumą maždaug 50 procentų, palyginti su grupėmis be LED, o dažiklis su LED – maždaug 55 procentais. Vien dažiklio grupė statistiškai nesiskyrė nuo nepaveiktos kontrolinės grupės. Pagal DNR nustatytas ląstelių skaičius vien dažiklio, vien LED ir dažiklio su LED grupėse buvo reikšmingai mažesnis nei kontrolinėje grupėje, tačiau tarp šių trijų grupių reikšmingo skirtumo nebuvo. Autoriai pasekmę įvardija tiesiai: taikytas poveikis nesunaikino susiformavusios prisitvirtinusios polimikrobinės bioplėvelės, o brandžią periodonto bioplėvelę reikia mechaniškai suardyti; fotodinaminis poveikis gali būti nebent papildoma priemonė.

Ankstyvųjų kolonizatorių tyrime vertinamasis rodiklis buvo selektyviosiose terpėse išaugintų gyvybingų mikroorganizmų skaičius, išreikštas logaritmine skale. Dažiklio be šviesos grupė nesiskyrė nuo fiziologinio tirpalo grupės. Abi fotoaktyvintos grupės – lazeris su kapsuliuotu dažikliu ir LED su kapsuliuotu dažikliu – sumažino gyvybingų mikroorganizmų skaičių iki maždaug 4 log, palyginti su neigiama kontrole. Pagal šį rodiklį tai yra sumažėjimas 10,000 kartų, arba 99.99 procento; nė viena grupė statistiškai nesiskyrė nuo chlorheksidino grupės. Vien šviesos ir vien dažiklio tamsoje grupių vertės nebuvo pateiktos kaip atskiri patikimi logaritminiai skaičiai, todėl sąžininga santrauka yra tokia, kokią pagrindžia straipsnis: fotoaktyvintas kapsuliuotas dažiklis sukėlė sumažėjimą, dažiklis tamsoje jo nesukėlė, o šiame jaunos bioplėvelės modelyje poveikio dydis atitiko antiseptiko etaloną.

Nė viename straipsnyje nematuotas pakartotinis augimas po poveikio, likutinė biomasė ar matricos struktūra. CFU sumažėjimas nieko nepasako apie likusią matricą. Metabolinio aktyvumo kritimas nieko nepasako apie išlikusius gyvybingus mikroorganizmus. Skaičiavimas pagal DNR negali parodyti, kurie mikroorganizmai yra gyvi.

Tyrimo metodų ir vertinamųjų rodiklių palyginimas

Ši lentelė yra šio straipsnio palyginimo priemonė. Skaitydami eilutę matysite, ką įrodo konkretus tyrimas, o skaitydami stulpelį – į kuriuos klausimus neatsako nė vienas tyrimas.

Verta pabrėžti tris skirtumus. Pirma, brandžios bioplėvelės modelyje vien šviesos grupė paaiškina beveik visą metabolinį poveikį, todėl 55 procentų rodiklis nereiškia dažiklio sukelto sunaikinimo. Antra, jaunos bioplėvelės modelyje formuluotė tamsoje yra neveikli, o poveikis pasireiškia tik su šviesa – tai fotoaktyvinimo požymis. Trečia, pagal DNR nustatyto skaičiaus sumažėjimas 80 procentų matematiškai atitiktų maždaug 0.7 log tik tada, jei kintamasis būtų gyvybingų mikroorganizmų skaičius. Tačiau taip nėra, todėl jo niekada negalima cituoti kaip logaritminio sunaikinimo rodiklio. Susijęs dantų bioplėvelių kontekstas pateikiamas burnos bioplėvelių ir odontologinių tyrimų rinkinyje, o bendras modelių, taikymo kelių ir vertinamųjų rodiklių atskyrimo lyginant tyrimus metodas išsamiai aprašytas laboratorinių metodų vadove.

Kodėl bioplėvelių tyrimams reikia atskirų interpretavimo taisyklių

Keturi kintamieji lemia, ar metileno mėlynojo poveikio bioplėvelei rezultatas turi reikšmės už konkrečios tyrimo plokštelės ribų.

Pirmiausia – bioplėvelės amžius ir matrica. Senesnės bioplėvelės yra storesnės, turi daugiau skersinių jungčių, o dažikliui į jas prasiskverbti sunkiau. 2021 m. tyrimo autoriai pagrindiniais ribojančiais veiksniais įvardija prasiskverbimą ir prastą šviesos sklidimą per organizuotą bioplėvelę. Nešiklių strategijos, tokios kaip kapsuliavimas ciklodekstrinu, yra bandymas įveikti būtent šį ribojimą, todėl formuluotė yra eksperimentinis kintamasis, o ne smulkmena.

Antra – dozės aritmetika. Čia energinės apšvitos vertės, esant tam pačiam bangos ilgiui, skiriasi beveik keturiasdešimt kartų – nuo 8.1 iki 320 J vienam kvadratiniam cm, o apšvitos intensyvumas svyruoja nuo 90 mW iki kelių W vienam kvadratiniam cm. Tas pats bangos ilgis nereiškia tokios pačios ekspozicijos, o nė viename tyrime dozė nekeičiama pakankamai sistemingai, kad būtų galima nustatyti kreivę.

Trečia – kontrolinės grupės. Tyrimas be dažiklio tamsoje grupės negali atmesti paties dažiklio toksiškumo, o tyrimas be vien šviesos grupės negali jokio poveikio priskirti fotoaktyvinimui. Abiejuose straipsniuose yra abi kontrolės – tai jų privalumas. Brandžios bioplėvelės tyrimas parodo, kodėl svarbi vien šviesos grupė: be jos metabolinis rezultatas būtų interpretuojamas kaip dažiklio poveikis.

Ketvirta – vertinamieji rodikliai. Gyvybingumas, metabolizmas, DNR kiekis, biomasė, struktūra ir pakartotinis augimas pagrindžia šešis skirtingus teiginius. Nė viename iš čia aptariamų straipsnių nematuojama daugiau nei du iš jų. Ypač svarbu tai, kad pakartotinis augimas nevertintas nė viename tyrime, todėl poveikio išlikimas yra neišmatuotas, o ne įrodytas.

Ko šie tyrimai neįrodo apie infekcijos gydymą

Nė viename iš šių modelių nėra kraujotakos, imuninių ląstelių, seilių tekėjimo, dantenų vagelės skysčio apykaitos ar mechaninio apnašų pašalinimo. Dažiklio koncentracija šulinėlyje nėra jo koncentracija audiniuose po bet kokio vartojimo būdo žmogui. Vienkartinė 5 minučių ar 90 sekundžių ekspozicija, taikoma jaunai ar net brandžiai laboratorinei bioplėvelei, nėra gydymo kursas. Brandžios bioplėvelės tyrimo autoriai patys tai pasako, fotodinaminį poveikį apibrėždami kaip galimą mechaninio pašalinimo papildymą, o ne savarankišką visiško sunaikinimo metodą.

Tiksli santrauka yra siaura ir tvirtai pagrįsta. Fotoaktyvintas metileno mėlynasis gali slopinti brandžios laboratorinės burnos mikroorganizmų bendrijos metabolizmą ir mažinti pagal DNR nustatytą jos gausumą, jos nesunaikindamas; tokiomis sąlygomis didžiąją metabolinio poveikio dalį sukelia vien šviesa. Fotoaktyvintas ciklodekstrinu pernešamas dažiklis gali sumažinti gyvybingų mikroorganizmų skaičių jaunoje laboratorinėje streptokokų bioplėvelėje keliomis dydžio eilėmis – tiek, kiek tame pačiame modelyje jį sumažina chlorheksidinas. Ar kurį nors iš šių stebėjimų galima pritaikyti žmogaus infekcijai, priklauso nuo medžiagos pristatymo, šviesos prieinamumo, deguonies, anatomijos ir klinikinių vertinamųjų rodiklių, kurių šie eksperimentai nebuvo skirti matuoti.