Metileno mėlynasis ir ALS: kodėl skirtingų eksperimentinių modelių rezultatai skiriasi

Ieškodami informacijos apie metileno mėlynąjį ir ALS, rasite du teiginius, kurie atrodo prieštaraujantys vienas kitam. Vienas teigia, kad mėlynasis dažiklis apsaugojo neuronus ALS modeliuose. Kitas teigia, kad ALS pelių modelyje jis nieko nepakeitė. Abu teiginiai remiasi tikrais moksliniais straipsniais, ir abu straipsnius verta vertinti rimtai. Prieštaravimas išnyksta įvardijus kiekvieno eksperimento esmę: teiginio ribas apibrėžia modelis.

Kirmėlėje gautas rezultatas pagrindžia teiginį apie kirmėlę. Žuvies lervoje gautas rezultatas pagrindžia teiginį apie žuvies lervą. Nė vienas iš jų nepagrindžia teiginio apie pacientą, kol to nepatvirtina žinduolio ligos eigos tyrimas. Šiame straipsnyje greta palyginami du dažniausiai cituojami moksliniai straipsniai, kad galėtumėte suprasti, kodėl jų atsakymai skiriasi.

Du eksperimentai vienoje lentelėje

Skaitydami laikykite šią lentelę atvertą. Joje telpa visi svarbūs šių tyrimų skirtumai.

Skiriasi genetika, rūšys, vartojimo būdas, pradžios laikas ir vertinamosios baigtys. Genotipas yra tik vienas iš penkių skirtumų, todėl šių dviejų tyrimų palyginimas negali įrodyti, kad metileno mėlynasis selektyviai veikia vieną ALS mechanizmą. Jis įrodo siauresnį, bet vis tiek naudingą dalyką: ryškus pagerėjimas paprastuose modeliuose, taikant ankstyvą tiesioginę ekspoziciją, nepasikartojo žinduolių ligos eigos tyrime, preparatą ilgai vartojant per burną.

Teigiamas rezultatas: ką parodė kirmėlių ir žuvų tyrimas

2012 m. kirmėlių ir žuvų tyrime kirmėlių motoriniuose neuronuose buvo ekspresuojamas mutantinis žmogaus TDP-43 arba FUS, o į žuvų embrionus suleista mutantinė žmogaus mRNR. Tai proteotoksiškumo modeliai. Per kelias dienas jie atkuria toksinį mutantinio baltymo poveikį judėjimui ir neuronų formai, o ne visą suaugusio žmogaus ALS eigą, trunkančią metus.

Gydymas pradėtas labai anksti. Kirmėlės nuo išsiritimo augo ant agaro su metileno mėlynuoju. Praėjus 24 valandoms po apvaisinimo, žuvų embrionai buvo palikti preparato tirpale per naktį, o jų elgsena tirta maždaug po dviejų dienų. Tarp preparato ir neurono nebuvo tokio hematoencefalinio barjero kaip žinduolio organizme, o preparato koncentracija plazmoje ar smegenyse nebuvo matuota.

Tokiomis sąlygomis poveikis buvo ryškus ir nuoseklus. Tiek 6, tiek 60 μM sumažino su amžiumi susijusį TDP-43 ir FUS kirmėlių paralyžių. 12-ą suaugusio organizmo gyvenimo dieną maždaug 80 procentų negydytų TDP-43 kirmėlių buvo paralyžiuotos, palyginti su maždaug 10 procentų kirmėlių, gydytų nuo išsiritimo. Sinapsių funkcijos tyrimas rodė tą pačią kryptį: TDP-43 kirmėlės buvo pernelyg jautrios aldikarbui, preparatui, naudojamam nervinio impulso perdavimui į raumenis tirti, o metileno mėlynasis priartino atsaką prie normalaus. Degeneruojančių motorinių neuronų ataugų skaičius sumažėjo; aiškiausias poveikis nustatytas esant 60 μM. Žuvų plaukimas, sukeltas prisilietimo, gerokai pagerėjo, o sutrumpėję motoriniai aksonai, esant 30 arba 60 μM, pailgėjo artėdami prie normalaus ilgio, nors atkūrimas buvo dalinis, o ne visiškas.

Oksidacinio streso duomenys dera su antioksidacinio poveikio interpretacija. Mutantinių kirmėlių ir žuvų reaktyviųjų deguonies formų rodikliai buvo padidėję ir gydant sumažėjo, o normalios kirmėlės, veikiamos metileno mėlynojo, prooksidacinio poveikio sąlygomis išgyveno gerokai ilgiau nei negydytos. Tačiau svarbūs du ribotumai. Bendras mutantinių TDP-43 ir FUS baltymų kiekis nesumažėjo, o baltymų agregatai tyrime nebuvo tiesiogiai kiekybiškai įvertinti, todėl tyrimas rodo funkcijos atkūrimą, bet neįrodo agregatų pašalinimo. Sekantiems, kaip paprastai formuluojamos redokso ir mitochondrijų hipotezės, šį mechanizmą reikėtų laikyti pagrįstu duomenimis, bet dar ne galutinai patvirtintu.

Daugiausia įžvalgų suteikė gydymo pradžios laikas. Kai autoriai gydymą pradėjo tik 5-ą suaugusio organizmo gyvenimo dieną, 12-ą dieną paralyžiaus dažnis buvo maždaug 55 procentai, o ne maždaug 10 procentų, kaip gydant nuo išsiritimo. Tas pats preparatas, ta pati kirmėlė, ta pati mutacija, bet gerokai mažesnis poveikis. Didelę dalį stebėtos naudos lėmė ankstyva profilaktinė ekspozicija.

Nulinis rezultatas: ką parodė SOD1 pelių tyrimas

2011 m. pelių tyrime sudėtingesnis klausimas buvo nagrinėjamas griežtesnėje sistemoje. Kongeninėms SOD1 G93A pelėms liga progresuoja nuo užpakalinių galūnių drebėjimo iki eisenos sutrikimo, apsivertimo į normalią padėtį reflekso praradimo ir iš anksto apibrėžtos galutinės baigties. Gydymas pradėtas dar prieš simptomus, 45-ą dieną, ir tęstas kasdien, stebėtojams vertinant neurologinę būklę pagal skalę nuo 0 iki 6. Tai visos ligos eigos eksperimentas, todėl jis artimesnis tam, kas rūpėtų pacientui, nei bet kuri kirmėlių paralyžiaus kreivė.

Pagrindiniai rezultatai buvo nuliniai. Bendra simptomų pradžia kontrolinėje grupėje nustatyta po 121 dienos, o metileno mėlynojo grupėje – po 124 dienų; šis skirtumas nebuvo reikšmingas. Išgyvenamumas iki galutinės stadijos buvo atitinkamai 167 ir 170 dienų; šis skirtumas taip pat nebuvo reikšmingas. Keletas antrinių analizės rezultatų buvo palankūs gydymui: patelėms simptomų pradžia vėlavo maždaug 7 dienas, o gydyti gyvūnai kiek ilgiau išbuvo lengvesnėse stadijose ir trumpiau – sunkiose. Dėl mažų pagal lytį sudarytų pogrupių ir daugelio stadijų palyginimų šie rezultatai veikiau padeda kelti hipotezes, o ne yra įrodymas. Nebuvo skaičiuojami neuronai, tiriama SOD1 agregacija ar matuojami oksidaciniai bei uždegiminiai žymenys, todėl tyrimas taip pat negali parodyti, ar preparatas pasiekė savo taikinius ir nesuveikė, ar tokia dozė jų apskritai nepaveikė. Tirta tik viena dozė.

Patys autoriai atkreipė dėmesį į svarbiausią ribotumą, kuris taikomas abiem kryptimis. Modelis, turintis daug SOD1 G93A kopijų, gerai atkuria ligą, kurią lemia toksinis SOD1 poveikis, tačiau su SOD1 susijusi liga sudaro nedidelę šeiminės ALS dalį ir biologiškai skiriasi nuo daugumos sporadinių atvejų. Jie pasiūlė pakartotinai tirti kandidatus TDP-43 pagrįstuose žinduolių modeliuose. Vėliau šis pasiūlymas tapo sudėtingesnis, nes kirmėlių ir žuvų tyrimo autoriai pažymi, kad atskirame metileno mėlynojo tyrime su TDP-43 pelėmis motorinės baigtys taip pat nepagerėjo. Taigi junginys vienoje TDP-43 sistemoje gali atrodyti labai veiksmingas, o kitoje TDP-43 sistemoje – neturintis poveikio. Sistema svarbi ne mažiau nei genas.

Kodėl pagerėjimas kirmėlėse ar žuvyse negali patvirtinti naudos pacientams

Kiekvieną modelį vertinkite kaip atsakantį į skirtingą klausimą.

Pirma, skiriasi biologija. TDP-43 ir FUS yra nukleorūgštis surišantys baltymai, turintys bendrų genetinių sąveikų šiose paprastose sistemose, o SOD1 toksiškumas pasireiškia per iš dalies skirtingus pirminius mechanizmus. Preparatas, mažinantis vienos rūšies proteotoksinį stresą, nebūtinai mažins kitą, o sėkmė esant pernelyg didelei ekspresijai embrione nebūtinai prognozuoja sėkmę esant lėtai suaugusio organizmo neurodegeneracijai, lydimai uždegimo, glijos dalyvavimo ir sisteminio būklės blogėjimo.

Antra, skiriasi ekspozicija. Nuolatinis poveikis terpėje esant mikromolinėms koncentracijoms nėra tas pats, kas vartojimas per burną. Tarp nurytos dozės ir nugaros smegenų motorinio neurono yra absorbcija žarnyne, pirmojo prasiskverbimo metabolizmas, prisijungimas prie plazmos baltymų, patekimas į smegenis ir klirensas. Nė viename tyrime nebuvo matuota preparato koncentracija nervų sistemoje, todėl nė vienas negali susieti savo koncentracijos su kito tyrimo koncentracija.

Trečia, skiriasi pradžios laikas. Nauda kirmėlėms ir žuvims labai priklausė nuo gydymo pradžios, kol dar nebuvo susikaupę patologinių pokyčių. Pelės taip pat pradėtos gydyti prieš simptomų atsiradimą, ir tai yra tyrimo stiprybė, tačiau žmonių gydymas beveik visada prasidėtų jau atsiradus simptomams, taigi dar vėliau. Profilaktinio poveikio signalas dviejų dienų embrionų tyrime yra atspirties taškas tolesniems tyrimams, o ne klinikinio naudojimo modelis.

Ketvirta, skiriasi vertinamosios baigtys. Paralyžius po 12 dienų, jautrumas aldikarbui, aksono ilgis mikrometrais ir nuplauktas atstumas yra artimi tiriamam mechanizmui fenotipiniai rodikliai. Simptomų pradžia ir išgyvenamumas žinduolio organizme apima visus kompensuojančius ir eigą komplikuojančius organizmo procesus. Preparatai dažnai pakeičia tiesioginius rodiklius, nepakeisdami išgyvenamumo; būtent todėl žinduolių tyrimuose naudojamos laiko iki įvykio baigtys.

Skaitytojai, norintys kontrolinio klausimų sąrašo kitai antraštei įvertinti, gali pasinaudoti straipsniu apie tai, kaip skaityti ikiklinikinius tyrimus: klauskite, kokia rūšis ir transgenas tirti, kokia dozė ir vartojimo būdas taikyti, ar matuota preparato koncentracija, kada gydymas pradėtas patologinių pokyčių atžvilgiu, ar vertinta trumpalaikė fenotipinė baigtis, ar ligos eiga ir ar poveikis pakartotas kitoje laboratorijoje. Platesnė metileno mėlynojo tyrimų su žmonėmis įrodymų bazė tebėra vieta, kur reikia tikrinti, ar kuris nors iš šių ankstyvųjų signalų virto klinikiniais duomenimis.

Ką tai reiškia pacientams ir jų šeimoms

Iš šių straipsnių nekyla joks patvirtintas metileno mėlynojo vartojimo sergant ALS protokolas. Teigiamas tyrimas pagrindžia tolesnius oksidacinių ir sinapsinių mechanizmų tyrimus TDP-43 ir FUS biologijos kontekste. Nulinis tyrimas nesuteikia pagrindo tikėtis ligos eigos pakeitimo esant su SOD1 susijusiai ligai, preparatą ilgai vartojant per burną ir pasiekiant tokią ekspoziciją. Kartu jie parodo skirtingų modelių rezultatų nenuoseklumą, o ne gydymo rekomendaciją.

Saugumą reikia vertinti taip pat blaiviai kaip veiksmingumą. ALS tyrimai su pelėmis nieko nepasako apie saugų dozavimą žmonėms, o metileno mėlynasis kelia realią hemolizės riziką esant G6PD trūkumui ir serotonino toksinio poveikio riziką vartojant kartu su serotoninerginiais vaistais. Įtariamas G6PD trūkumas, dabartinis antidepresantų vartojimas ir bet kokie planuojami vaistų vartojimo pokyčiai yra temos pokalbiui su gydytoju; taip pat svarbu peržiūrėti bendruosius metileno mėlynojo saugumo duomenis prieš imantis veiksmų pagal laboratorinių tyrimų antraštes.

Esmę galima nusakyti vienu sakiniu. Ankstyva metileno mėlynojo ekspozicija ryškiai pagerino TDP-43 ir FUS kirmėlių bei žuvų lervų fenotipinius rodiklius, tačiau ilgalaikio vartojimo per burną SOD1 pelių tyrime iš esmės nesuteikė naudos simptomų pradžiai ar išgyvenamumui, todėl sąžininga interpretacija yra nuo modelio priklausantys įrodymai, nepagrindžiantys vartojimo pacientams.