Metileno mėlis ir uždegiminė signalizacija: inflamasomos, IL-6 ir STAT3

Tarkime, trys laboratorijos praneša, kad tas pats mėlynas junginys pasižymi priešuždegiminiu poveikiu. Viena nustato mažesnį makrofagų išskiriamo IL-1beta kiekį. Kita nustato mažesnį iNOS fermento kiekį to paties tipo ląstelėse. Trečia nustato mažesnį IL-6 kiekį kraujyje ir mažesnį STAT3 aktyvumą smegenyse. Kyla pagunda visus tris rezultatus sujungti į vieną teiginį. Tačiau taip sujungus paslepiama tai, kas iš tiesų nustatyta.

Kiekvienas rezultatas susijęs su skirtingu signalizacijos mechanizmu, turinčiu savą dirgiklį, komplekso susidarymo etapą ir matuojamą rodiklį. Metileno mėlis kiekvieną mechanizmą veikia skirtingame taške. Ar kuris nors iš šių poveikių pagerina sveikatos baigtis, yra atskiras klausimas, aptariamas mūsų metileno mėlio ir uždegimo apžvalgoje. Šiame puslapyje nagrinėjami tik signalizacijos keliai.

1 kelias: inflamasomų susidarymas ir kaspazė-1

Inflamasoma yra baltyminis karkasas, prireikus susidarantis mieloidinės ląstelės viduje. Jį sudaro jutiklis, adaptorius, vadinamas ASC, ir efektorinis fermentas, vadinamas kaspaze-1. Kompleksui susidarius, kaspazė-1 suskaido pro-IL-1beta ir pro-IL-18 į jų sekretuojamas formas ir gali sukelti piroptozę – uždegiminę ląstelių žūties formą. Tipą lemia jutiklis: NLRP3 reaguoja į kristalus ir poras formuojančius toksinus, tokius kaip nigericinas ir ATP, NLRC4 reaguoja į bakterijų flageliną, AIM2 reaguoja į citozolinę dvigrandę DNR, o nekanoninis kelias reaguoja į ląstelės viduje esantį lipopolisacharidą.

Aktyvacijai reikia dviejų signalų. Pirmasis signalas yra parengimas: Toll tipo receptoriaus ligandas skatina nuo NF-kB priklausomą NLRP3 ir pro-IL-1beta transkripciją, kad susidarytų reikiami komponentai. Antrasis signalas yra komplekso susidarymas: antras dirgiklis sukelia ASC oligomerizaciją į sankaupas, kaspazės-1 skaidymą, susidarant jos p20 fragmentui, ir subrendusio IL-1beta p17 išskyrimą. Žinoma, kad mitochondrijų reaktyviosios deguonies formos ir kristalų įsiurbimas prisideda prie antrojo NLRP3 signalo.

2017 m. makrofagų tyrime, kuriame nagrinėtas įvairių inflamasomų slopinimas, metileno mėlis buvo tiriamas abiejų signalų etapuose. Lipopolisacharidu parengtuose pelių kaulų čiulpų makrofaguose nigericinas, ATP ir mononatrio urato kristalai sukėlė IL-1beta bei kaspazės-1 išskyrimą ir ASC sankaupų susidarymą, o 20–200 mikromolių koncentracijos metileno mėlis sumažino visus tris rodiklius priklausomai nuo dozės, nežudydamas ląstelių. Toks pat dėsningumas nustatytas naudojant flageliną ir Salmonella NLRC4 aktyvuoti, dvigrandę DNR ir Listeria AIM2 aktyvuoti bei transfekcijos būdu įvestą lipopolisacharidą arba gyvas E. coli nekanoniniam keliui aktyvuoti. Vien junginys išskyrimo nesukėlė, o kontrolinėse plokštelėse antibakterinio poveikio nenustatyta, todėl rezultatas siejamas su šeimininko atsaku.

Ankstesniuose kelio etapuose išmatuoti trys poveikiai. Metileno mėlis sumažino rotenono sukeltą mitochondrijų superoksido susidarymą, o kartu sumažėjo ir rotenono skatinamas IL-1beta išskyrimas. Sumažėjo fluorescencinių dalelių įsiurbimas, o tai atitinka sumažėjusią fagocitozę prieš kristalų atpažinimą. Reporterio, valdomo NLRP3 promotoriaus su dviem NF-kB prisijungimo vietomis, aktyvumas veikiant metileno mėliui sumažėjo, o sutrumpintas promotorius be šių vietų nereagavo. Mėgintuvėlyje be ląstelių metileno mėlis taip pat tiesiogiai sumažino rekombinantinės žmogaus kaspazės-1 aktyvumą. Pridėjus junginio tik parengimo arba tik aktyvacijos etape, IL-1beta, IL-18 ir kaspazės-1 išskyrimas vis tiek sumažėjo, taigi paveikiami abu etapai.

Bandymų su pelėmis rezultatai atitiko šį selektyvumą. Mirtina lipopolisacharido dozė per kelias valandas pražudė kontrolines peles, o metileno mėlis pagerino išgyvenamumą; IL-1beta kiekis pilvaplėvės ertmėje sumažėjo, tačiau IL-6 kiekis tame pačiame skystyje nepakito. Listeria sukelto peritonito modelyje IL-1beta kiekis pilvaplėvės ertmėje sumažėjo, o bendras ląstelių skaičius nepakito. Žmogaus THP-1 monocitai visuose keturiuose inflamasomų tipuose reagavo panašiai kaip pelių makrofagai. Su inflamasomomis susijęs rezultatas paaiškina IL-1beta ir IL-18 brendimą, bet ne kiekvieno citokino pokyčius. Dėl tos pačios priežasties smegenų imuninių ląstelių forma mikroglijos ir astrocitų eksperimentuose atsako į kitą klausimą nei baltyminio karkaso susidarymas.

2 kelias: iNOS transkripcija per NF-kB ir STAT1 prisijungimą

Indukuojamosios azoto monoksido sintazės, arba iNOS, ramybės būsenoje beveik nėra, o jos transkripcija vyksta pagal poreikį. Lipopolisacharidas ją skatina daugiausia per IkB-alpha skaidymą, po kurio vyksta NF-kB fosforilinimas ir patekimas į branduolį. Interferonas-gama ją skatina daugiausia per Janus kinazės atliekamą STAT1 fosforilinimą, po kurio STAT1 patenka į branduolį. Tada kiekvienas veiksnys prisijungia prie savo vietos iNOS promotoriuje. Fermento aktyvumas ir geno indukcija yra atskiri reguliavimo taškai, o vaistas gali veikti vieną iš jų arba abu.

2015 m. iNOS indukcijos makrofaguose ir endotoksemiją patiriančiose pelėse tyrimas parodė poveikį informacinės RNR lygmeniu. RAW 264.7 ląstelėse ir pirminiuose pelių makrofaguose 1 mikromolio koncentracijos metileno mėlis, pridėtas likus 30 minučių iki lipopolisacharido, interferono-gama arba abiejų poveikio, per 8–24 valandas sumažino iNOS baltymo ir mRNA kiekį; terpėje buvo mažiau nitrito, o ląstelių gyvybingumas nesumažėjo. Pelėms, kurioms buvo skirta 25 mg lipopolisacharido vienam kg, vienkartinė 5 mg vienam kg dozė, skirta valanda anksčiau, sumažino iNOS baltymo ir mRNA kiekį plaučiuose, kepenyse ir širdyje.

Išskirtinė detalė yra tai, kas nepasikeitė. IkB-alpha skaidymas, NF-kB fosforilinimas, STAT1 fosforilinimas ir abiejų veiksnių kaupimasis branduolyje liko nepakitę. Sutrikimas pasireiškė vienu etapu vėliau: branduolių ekstraktuose nustatytas mažesnis NF-kB prisijungimas prie jam būdingo DNR elemento po lipopolisacharido poveikio ir mažesnis STAT1 prisijungimas po interferono-gama poveikio, o chromatino imunoprecipitacija patvirtino mažesnį abiejų veiksnių prisijungimą prie iNOS promotoriaus ląstelėse. Taip pat sumažėjo navikų nekrozės faktoriaus alfa, kurio promotorius irgi naudoja NF-kB, kiekis. Veiksniai buvo aktyvuoti ir pateko į reikiamą vietą, tačiau silpnai jungėsi prie savo taikinio DNR.

Atkreipkite dėmesį į skirtumą nuo 1 kelio. Čia nagrinėjamas veiksnio prisijungimas prie DNR, dalyvauja STAT1, o ne STAT3, ir matuojami mRNA, baltymo bei nitrito kiekiai, o ne ASC sankaupos ir kaspazės-1 fragmentai. Mūsų metileno mėlio taikinių skirtinguose ląstelių modeliuose žemėlapyje šis transkripcijos lygmuo atskiriamas nuo tiesioginių fermentų ir mitochondrijų rodiklių matavimų.

3 kelias: IL-6 serume ir STAT3 aktyvacija audiniuose

IL-6 perduoda signalą per gp130 receptorių šeimą į Janus kinazės ir STAT3 kaskadą. Fosforilintas STAT3 dimerizuojasi, patenka į branduolį ir skatina uždegimines programas, o pats IL-6 yra NF-kB taikinys, todėl jie sudaro grįžtamojo ryšio kilpą, dažnai vadinamą IL-6–STAT3 ašimi. Įprasti matuojami rodikliai yra IL-6 kiekis serume ankstesniame kelio etape, fosforilinto ir bendro STAT3 kiekio santykis bei efektoriniai fermentai, tokie kaip iNOS ir COX2, vėlesniuose etapuose.

2023 m. pelių tyrime, kuriame nagrinėti IL-6 ir STAT3 po lipopolisacharido poveikio, ši ašis buvo vertinama skirtingose organizmo terpėse ir audiniuose. C57BL/6 pelių patinams tris dienas kasdien buvo skiriama 1 mg lipopolisacharido vienam kg, o praėjus 30 minučių po kiekvienos dozės – 5 arba 10 mg metileno mėlio vienam kg. Trečią dieną IL-6 kiekis serume abiejose metileno mėlio grupėse buvo mažesnis nei gavus vien lipopolisacharido, o daugumos kitų tirtų citokinų kiekiai po metileno mėlio skyrimo nepakito. Fosforilinto ir bendro STAT3 kiekio santykiai buvo mažesni smegenų žievėje, hipokampe ir ausies odoje; kartu nustatytas silpnesnis mikroglijos dažymas Iba-1 žymeniu, mažesni iNOS ir COX2 kiekiai bei iš dalies sumažėjęs kūno masės netekimas.

Čia svarbios dvi išlygos. Mažesnis IL-6 kiekis serume kartu su mažesniu STAT3 fosforilinimu audiniuose atitinka ašies moduliavimą, tačiau neleidžia išskirti pagrindinio poveikio taško, nes mažesnis citokino kiekis ankstesniame etape, silpnesnė receptoriaus signalizacija ar pakitęs fosfatazių aktyvumas galėtų lemti tokį patį santykį. Be to, kūno masė per tris ūmaus poveikio dienas yra viso gyvūno rodiklis, o ne simptomų ar remisijos įvertis. Ji suteikia daugiau konteksto nei vien imunoblotas, tačiau nepaverčia signalizacijos rezultato teiginiu apie gydymą. Atskiri mitochondrijų oksidacijos ir redukcijos procesai vyksta lygiagrečiai šiems citokinų procesams ir neturėtų būti su jais sutapatinami.

Kelių palyginimas: poveikio taškai ir matuojami rodikliai

Lentelė neleidžia daryti trijų nepagrįstų išvadų. ASC sankaupų rezultatas neįrodo STAT3 rezultato. STAT1 prisijungimo prie iNOS promotoriaus rezultatas neįrodo STAT3 rezultato, nors abu baltymai priklauso STAT šeimai. IL-6 kiekio serume rezultatas neįrodo sumažėjusio inflamasomų susidarymo: pilvaplėvės ertmės eksperimente IL-1beta kiekis sumažėjo, o IL-6 – ne. Kiekvienai eilutei reikia savo dirgiklio ir matuojamo rodiklio, todėl skaitant metileno mėlio tyrimus su ląstelėmis, gyvūnais ir klinikinius tyrimus būtina kiekvieną teiginį susieti su tuo lygmeniu, kuriame atlikti matavimai.

Nė vienas iš šių rezultatų nenustato dozavimo, saugumo ar naudos žmonėms. Lipopolisacharido modeliai yra kontroliuojami dirgikliai mechanizmui tirti, o ne lėtinių ligų kopijos; junginio skyrimas kartu su dirgikliu tiria sukelto pokyčio prevenciją, o ne jau išsivysčiusios ligos panaikinimą. Šį mechanizmų aptarimą laikykite atskirai nuo pacientų baigčių, o bet kokį teiginį apie poveikį sveikatai vertinkite pagal jį pagrindžiantį tyrimą su pacientais.