Metileno mėlis DNR ir RNR dažymui: naudojimas geliuose ir ant membranų

Studentas atlieka elektroforezę agarozės gelyje, nudažo jį metileno mėliu ir nieko nemato ten, kur tikėjosi ryškios juostos. Gretimoje darbo vietoje podoktorantūros tyrėjas tuo pačiu mėlynu tirpalu nudažo Northern bloto membraną ir per tris minutes gauna aiškias ribosomines juostas. Studentas nusprendžia, kad elektroforezė nepavyko. Tačiau ji pavyko. Užduotys buvo skirtingos, o tas pats dažiklis jas atlieka skirtingu jautrumu, su skirtingu fonu ir skirtingomis tolesnių veiksmų taisyklėmis.

DNR ir RNR dažymą metileno mėliu sieja ta pati chemija, bet ne paskirtis. Gelyje dažiklis parodo, kiek nukleorūgšties yra porėtoje matricoje. Ant membranos jis parodo, ar perkėlimas pavyko ir ar į takelius įkelti vienodi mėginio kiekiai. Supratus šį skirtumą, tampa aiškūs protokolai, aptikimo ribos ir suderinamumo apribojimai.

Trumpas atsakymas

Metileno mėlis yra plokščias katijoninis dažiklis, kuris jungiasi prie nukleorūgščių nekovalentiškai ir grįžtamai: dėl elektrostatinės traukos prie fosfatų, interkaliacijos tarp bazių porų ir sąveikos su mažuoju grioveliu. Būtent šis grįžtamumas ir svarbus. Juostas galima nudažyti, apžiūrėti regimojoje šviesoje, užfiksuoti vaizdą, o tada pašalinti dažiklį arba išgryninti mėginį klonavimui, hibridizacijai ar pakartotiniam zondavimui.

Dvivijės DNR dažymui metileno mėliu agarozės gelyje standartinis greitasis receptas yra 0.02 procento w/v (200 mikrogramų viename mL) tirpalas vandenyje, maždaug 15 minučių dažymas ir maždaug 15 minučių dažiklio šalinimas vandeniu, apžiūrint ant baltos šviesos šviestuvo. Membranoms klasikinis Northern bloto receptas yra 0.02–0.04 procento dažiklio tirpalas natrio acetate, kai pH yra apie 5.2: po perkėlimo ir imobilizavimo dažoma kelias minutes, tada skalaujama vandeniu ir prieš hibridizaciją visiškai pašalinamas dažiklis. Jautrumas nedidelis: geromis sąlygomis vienoje gelio juostoje aptinkama nuo dešimčių iki šimtų nanogramų, o konservatyviuose vadovuose nurodoma 0.5–1 mikrogramas. Tai keliomis dydžio eilėmis daugiau nei naudojant etidžio bromidą ir SYBR dažiklius. Membranoms nėra prasmingos vieno transkripto aptikimo ribos, nes dažiklis daugiausia parodo gausią ribosominę RNR ir bendrą įkelto mėginio kiekį. Nė viename recepte nenaudokite mažmeninėje prekyboje parduodamo maisto papildo tirpalo. Patvirtinti metodai numato analitinio grynumo dažiklį, apibrėžtos sudėties buferius ir darbą be RNazių, kai naudojama RNR.

Kaip vyksta jungimasis ir kada jis klaidina

Naudingą modelį sudaro trys dalys. Pirma, teigiamai įkrautą žiedų sistemą traukia neigiamai įkrautas fosfatinis karkasas. Spektroskopiniai tyrimai rodo, kad esant mažai druskų koncentracijai ši elektrostatinė sąveika vyrauja, o modeliavimo ir molekulinės dinamikos tyrimuose interkaliacija ir jungimasis mažajame griovelyje išlieka stabiliais jungimosi prie dvivijės DNR būdais, kaip apibendrinta metileno mėlio jungimosi prie DNR spektroskopiniame tyrime. Antra, nustatyta tam tikra pirmenybė GC: modeliavimas palankesnis CpG ir GpC žingsniams, o eksperimentuose pastebėtas pirmenybinis jungimasis prie GC gausių dupleksų, aprašytas metileno mėlio interkaliacijos pirmenybės tyrime. Tačiau dažiklis jungiasi ir prie AT dupleksų. Įprastas dažymas nėra specifinis sekai. Trečia, prie vienvijės DNR ir RNR daugiausia jungiamasi dėl elektrostatinių sąveikų ir susiklojimo sąveikų su prieinamomis bazėmis bei dupleksinėmis sritimis, todėl dažymo intensyvumas priklauso nuo ilgio, sekos ir antrinės struktūros.

Iš to kyla dvi pasekmės. Kadangi jungimasis nekovalentinis, dažiklis išsiplauna. Poliakrilamido juostos greitai išblunka, jei nėra specialiai fiksuojamos; atskiras nuolatinio fiksavimo variantas sukurtas būtent todėl, kad įprastas dažymas yra laikinas, kaip aprašė Soto ir Draper PAGE gelių tyrime. Kadangi dažiklis yra fotosensibilizatorius, ilgas ryškus nudažytos DNR apšvietimas, esant deguoniui, gali oksiduoti guaniną ir galiausiai sukelti vienos grandinės įtrūkius. Šis mechanizmas išsamiai aprašytas metileno mėlio fotosensibilizuojamos guanino oksidacijos tyrime. Trumpa apžiūra baltoje šviesoje leidžia išvengti gerai žinomo UV pažeidimo, būdingo klasikiniams etidžio bromido protokolams, ir tai yra tikras privalumas preparatyviai išskiriant DNR. Regimoji šviesa yra švelnesnė, bet ne nekenksminga. Jei DNR bus klonuojama, apšvietimas turi būti trumpas. Platesnį šio atsargumo fotocheminį pagrindą rasite straipsnyje apie du metileno mėlio fotochemijos kelius. Apie redokso porą ir krūvio būsenas, paaiškinančias, kodėl oksiduota forma jungiasi, o redukuota – ne, skaitykite straipsnyje apie metileno mėlio struktūros ir savybių chemiją.

Pirmoji užduotis: dažymas geliuose

Gelio dažymas atsako į vieną klausimą: ar šioje juostoje yra pakankamai nukleorūgšties, kad ją būtų galima pamatyti plika akimi. Geriausiai ištirtas atvejis – dvivijė DNR agarozėje. Pradinis Flores ir kolegų gelių dažymo metileno mėliu metodas patvirtino greitąjį 0.02 procento protokolą 1 procento agarozėje ir parodė, kad vėliau DNR galima sėkmingai išskirti ir klonuoti. Toks pats tiekėjo protokolas pateiktas IBI Scientific metileno mėlio produkto puslapyje, kuriame greta nurodyti 0.04 procento receptas membranoms ir greitasis variantas geliams.

Praktinė darbo eiga:

1. Elektroforezę gelyje atlikite įprastai. Dažykite po elektroforezės, o ne jos metu, nebent pakeisto metodo perkėlimas arba skiriamoji geba yra patvirtinti.
2. Panardinkite į 0.02 procento w/v metileno mėlio tirpalą distiliuotame vandenyje ir švelniai judindami dažykite maždaug 15 minučių.
3. Šalinkite dažiklį kelis kartus pakeisdami vandenį, iš viso maždaug 15 minučių, kol matricos fonas susilpnės ir juostos išryškės.
4. Nedelsdami fotografuokite ant baltos šviesos šviestuvo.

Agarozė ir poliakrilamidas elgiasi skirtingai. Agarozė sulaiko dažiklį matricoje, todėl dažiklio šalinimas yra lėtasis etapas. Ploni poliakrilamido geliai greitai nusidažo, bet ir greitai praranda dažiklį; tai padeda preparatyviai išpjauti juostas, tačiau apsunkina vaizdų išsaugojimą. Sintetinius oligonukleotidus poliakrilamide galima aptikti naudojant tą patį 0.02 procento tirpalą per 20–30 minučių, pakartotinai plaunant vandeniu pagal nusistovėjusius Current Protocols tipo PAGE metodus. Aprašyti ir labai praskiesti, apie 0.0002 procento tirpalai praskiestame TBE, naudojami preparatyviems oligonukleotidams dažyti kelias valandas, tačiau juos pagrindžiančių duomenų mažiau.

Svarbu, ar dažoma DNR, ar RNR. Dvivijė DNR užtikrina stipriausią jungimąsi prie struktūrinių sričių. RNR ir vienvijė DNR nusidažo, bet silpniau ir ne taip nuspėjamai. Naudodamos formaldehido agarozės gelius RNR analizei, dauguma laboratorijų praleidžia dažymą mėliu gelyje ir pirmiausia perkelia RNR ant membranos, o tada dažo ją ten. Taip silpnas gelio signalas pakeičiamas aiškesniu membranos signalu ir kartu užfiksuojamas mėginio įkėlimas.

Antroji užduotis: dažymas ant membranų

Membranos dažymas atsako į kitą klausimą: ar perkėlimas pavyko ir ar takelius galima palyginti. Klasikinis taikymas – Herrin ir Schmidt grįžtamasis Northern bloto dažymas. Pradinis receptas buvo 0.04 procento dažiklio tirpalas 50 mM natrio acetate, kai pH 5.0; dažoma 2–3 minutes, skalaujama vandeniu, o prieš hibridizaciją dažiklis pašalinamas praskiestu SDS tirpalu SSPE buferyje.

Plačiai naudojamo šiuolaikinio varianto eiga:

1. Perkelkite RNR arba denatūruotą DNR ant nailono ar nitroceliuliozės, tada imobilizuokite UV kryžminiu susiejimu arba kaitinimu, kad dažant mėginys nebūtų prarastas.
2. Neprivalomas, bet dažnas etapas: maždaug 15 minučių drėkinkite membraną 5 procentų acto rūgštyje.
3. Dažykite 5–10 minučių 0.02–0.04 procento metileno mėlio tirpalu 0.3–0.5 M natrio acetate, kai pH yra apie 5.2.
4. Skalaukite ir šalinkite dažiklį vandeniu 5–15 minučių, užfiksuokite vaizdą, tada prieš hibridizaciją pašalinkite dažiklio likučius.

Northern tyrimuose vyrauja teigiamai įkrautas nailonas. Nitroceliuliozė taip pat tinka tai pačiai darbo eigai su acto rūgštimi ir acetatu. Vaizdas naudojamas perkėlimui patvirtinti, 28S ir 18S juostoms palyginti (arba 23S ir 16S bakterijų RNR atveju), dydžio žymenims ir standartams pažymėti bei apytiksliam bendro RNR kiekio normalizavimo įrašui išsaugoti. Publikuotuose Northern metoduose dažytos ribosominės juostos kiekybiškai vertinamos įkeltam kiekiui patikrinti, įskaitant pienininkystės tyrimą, kuriame metileno mėliu nudažytos ribosominės juostos naudotos normalizavimui. Southern membranas galima vizualizuoti taip pat, tačiau šis dažiklis gerokai plačiau įsitvirtinęs kaip Northern mėginio įkėlimo ir perkėlimo patikros priemonė. Be to, Southern DNR prieš perkėlimą denatūruojama, todėl gelio jautrumo skaičių tiesiogiai taikyti negalima.

Aptikimo ribos ir fonas: kur mėlis nusileidžia

Toliau pateiktas palyginimas sąmoningai yra apytikslis. Dažiklio veiksmingumas priklauso nuo gelio procentinės koncentracijos, juostos pločio, optikos ir dažiklio šalinimo nuoseklumo. Kiekvieną skaičių vertinkite kaip dydžio eilės orientyrą, o ne specifikaciją.

Fono kontrolė lemia, ar nedidelis signalas bus naudingas. Laisvas dažiklis yra intensyvios spalvos, todėl kontrastas gaunamas pašalinant nesusijungusį dažiklį, bet išsaugant susijungusį. Didesnė dažiklio koncentracija retai padidina jautrumą. Ji daugiausia pailgina dažiklio šalinimą. Su konkrečiu geliu, membrana ir kamera išbandykite nuoseklių skiedimų seriją ir naudokite tik tą diapazoną, kuriame integruotas optinis tankis išlieka proporcingas pradiniam kiekiui. Metileno mėlis tinka pusiau kiekybiniam įkelto mėginio kiekio normalizavimui. Tai nėra didelio dinaminio diapazono kiekybinis tyrimas, nes membranos talpa, perkėlimo efektyvumas, prisotinimas ir dažiklio šalinimas skirtinguose takeliuose skiriasi.

Suderinamumo ribos: kas išlieka tinkama po dažymo

Įrodyta, kad po dažymo mėliu galima klonuoti. Flores ir kolegos išpjovė nudažytas agarozės juostas, išskyrė DNR, atliko ligavimą ir transformaciją bei nurodė geresnius klonavimo rezultatus nei po dažymo etidžio bromidu ir UV apšvietimo. Tikėtina priežastis – mažesnis fotopažeidimas, o ne paties dažiklio teikiama nauda. Baltos šviesos poveikis turi būti trumpas, o išskirtą DNR išgryninkite įprastu DNR išskyrimo iš gelio metodu.

PCR ir sekoskaitos atveju įrodymų mažiau. Dažiklio likučiai jungiasi prie nukleorūgščių, todėl prieš fermentinius etapus pašalinkite dažiklį ir išgryninkite mėginį. Tikimasi, kad tinkamai išgryninta DNR iš mėliu dažyto gelio bus tinkama, tačiau skirtingų polimerazių ir sekoskaitos cheminių sistemų tolerancija tiesiogiai perneštiems dažiklio likučiams nėra gerai kiekybiškai įvertinta. Nelaikykite jos savaime suprantama.

Bloto hibridizacija suderinama, kai griežtai laikomasi tvarkos: perkėlimas, imobilizavimas, dažymas, vaizdo fiksavimas, dažiklio pašalinimas, hibridizacija. Tokia yra Herrin ir Schmidt metodo seka. Dažymas prieš perkėlimą arba dažiklio pašalinimo praleidimas yra kitas metodas, kurį reikia atskirai patvirtinti. Pašalinus dažiklį, įprastas zondo pašalinimas ir pakartotinis zondavimas atliekami kaip visada. Apie ląstelių dažymą tos pačios šeimos dažikliais ir tai, kodėl fiksuotų tepinėlių metodikos negalima tiesiogiai taikyti gyvoms ląstelėms, skaitykite mikroskopinio dažymo atlase.

Juostų išpjovimas tinka preparatyviems agarozės geliams ir mėliu aptiktiems PAGE oligonukleotidams, jei nenaudojamas nuolatinio fiksavimo variantas. Elektroeliucija po dažiklio pašalinimo chemiškai tikėtina, nes dažiklis jungiasi grįžtamai, tačiau kontroliuojamų išeigos duomenų būtent apie metileno mėlį nedaug. Po eliucijos pašalinkite druskas arba nusodinkite nukleorūgštis.

Pasikartojančios nesėkmės

Blyškios gelio juostos paprastai reiškia, kad kolorimetriniam dažymui yra per mažai medžiagos, ypač trumpų vienvijų nukleorūgščių arba RNR atveju. Įkelkite daugiau mėginio, naudokite šviežią dažiklį, prieš didindami koncentraciją pailginkite dažymą ir anksčiau baikite dažiklio šalinimą. Vientisai mėlynas gelis be kontrasto paprastai reiškia pernelyg intensyvų dažymą arba per retą vandens keitimą. Blunkančios PAGE juostos yra tikėtinas cheminis reiškinys, o ne nepavykęs dažymas. Fotografuokite greitai. Netolygus membranos fonas rodo raukšles, burbuliukus, pirštų atspaudus, netolygų judinimą arba netolygų perkėlimą. Be hibridizacijos kontrolės nelaikykite to nevienodo mėginio įkėlimo įrodymu. Išplaukęs, silpnas ribosominių juostų vaizdas gali reikšti degradaciją, tačiau taip pat ir nepilną perkėlimą, per mažą bendrą RNR kiekį (įprastai viename takelyje būna nuo kelių iki dešimčių mikrogramų) arba pernelyg intensyvų dažiklio šalinimą. Dažiklis parodo gausią ribosominę RNR. Jis neparodo konkretaus transkripto. Tai zondo užduotis.

Sauga ir tvarkymas be nepagrįstų teiginių

Metileno mėlį tvarkyti paprasčiau nei etidžio bromidą, tačiau jis nėra nekenksmingas. Galiojančiame MilliporeSigma saugos duomenų lape dažiklis priskiriamas ūmaus toksiškumo prarijus 4 kategorijai ir nurodoma, kad jis kenksmingas prarijus, o atliekos turi būti šalinamos patvirtintu būdu pagal Sigma-Aldrich metileno mėlio saugos duomenų lapą. Etidžio bromidui taikomi griežtesni įspėjimai dėl genotoksiškumo, įskaitant įtariamą poveikį lytinėms ląstelėms, nurodytą jo Sigma-Aldrich saugos duomenų lape. Jo geliai ir tirpalai paprastai atskiriami kaip pavojingos cheminės atliekos, kaip pažymėta Thermo Fisher nukleorūgščių dažiklių vadove. Abiem atvejais laikykitės saugos duomenų lapo ir įstaigos taisyklių. Sausą dažiklį laikykite sandariai uždarytą ir sausą, darbinį dažymo tirpalą naudokite pakartotinai tik tiek, kiek leidžia protokolas, nudažytas membranas laikykite sausas tarp filtravimo popieriaus lapų, o gelius fotografuokite, kol juostos dar neišsisklaidė dėl difuzijos.

Prisiminkite trumpą taisyklę darbui laboratorijoje. Geliai parodo, ar esant dideliam įkeltam kiekiui juostos matomos baltoje šviesoje. Membranos parodo perkėlimą ir įkeltą kiekį prieš zondui atliekant jautrų aptikimą. Vienas dažiklis tinka abiem užduotims, tačiau jo jautrumas nedidelis, jungimasis grįžtamasis, o veiksmų tvarka griežta.