Kas sukūrė purpurinį kraujo dažymą? Metileno mėlynasis, Malachowskis, Romanowskis ir Giemsa

Eozinas yra raudonas. Metileno mėlynasis yra mėlynas. Sumaišykite juos, užtepkite mišinį ant išdžiovinto kraujo tepinėlio, ir kai kurios jo dalys nusidažys purpurine spalva.

Ne visos. Gerai paruoštame preparate baltųjų kraujo kūnelių branduoliai nusidažo raudonai purpurine spalva, o maliarijos parazito viduje chromatinas įgauna tą pačią spalvą; aplinkiniai eritrocitai lieka rausvi, o citoplazma – pilkai mėlyna. Būtent purpurinė spalva leidžia atskirti ląstelių tipus.

Nė viename buteliuke purpurinės spalvos nėra. Ji atsiranda tik tada, kai tam tikras metileno mėlynojo skilimo produktas ant objektinio stiklelio susitinka su eozinu, o XIX a. devintajame ir dešimtajame dešimtmečiuose niekas nežinojo, kad toks produktas egzistuoja, juolab kas jis yra. Šios spalvos ieškoję žmonės dirbo pavieniui, su negrynais dažais, neturėdami patikimo būdo nustatyti, kas yra buteliuke, du mėnesius stovėjusiame lentynoje.

Todėl į antraštės klausimą yra daugiau nei vienas pagrįstas atsakymas, ir todėl tas atsakymas pasikeitė 2011 m.

Vaizdas, kuris keitėsi kartu su mišiniu

Šis dažymas nebuvo išrastas vienu kartu. Jis susiformavo palaipsniui. Kiekvienas mišinio pakeitimas suteikdavo lygiai vieną naują matomos informacijos dalį, o šių dalių seka yra aiškiausias būdas suprasti istoriją.

Svarbiausia yra paskutinio stulpelio seka. Kiekvienas žingsnis pirmyn praplėtė spalvų gamą, o kiekvienas toks praplėtimas leido pamatyti dar vieną struktūrą. Purpurinė spalva nėra šio metodo puošmena; ji lemia skirtumą tarp galimybės pamatyti, kad parazitas yra, ir galimybės pamatyti, iš ko jis sudarytas. Kaip patys dažai iš BASF dažų gamyklos pateko į mediciną, pasakoja ilgesnė istorija, paremta savais dokumentais. Visa pirmiau pateikta seka su kiekvieno įrašo šaltiniu saugoma kaip prisidėjusių tyrėjų chronologija su nuorodomis į šaltinius.

Paveikslas: tie patys šeši mišiniai, pavaizduoti pagal tai, kas buvo inde ir kas iš jo išėjo. Apskritimuose pažymėti dažai, o po jais esančiuose blokeliuose – spalvos, kurias tie dažai galėjo suteikti kraujo tepinėliui. Iki 1890 m. nėra nė vieno raudonai purpurinio blokelio, o po šios datos jis yra visur.

Žmogus, kuris boraksą panaudojo sąmoningai

Ernstas Malachowskis buvo gydytojas Breslau mieste, dabartiniame Vroclave. Visą karjerą jis vertėsi privačia praktika ir dirbo nedidelėje klinikoje, kurią valdė kartu su kolega, o laboratorinius tyrimus atlikdavo laisvalaikiu. Jis gimė Strzelno mieste 1857 m. kovo 12 d., studijavo mediciną Breslau universitete ir nuo 1882 iki 1887 m. dirbo vidaus ligų asistentu Visų Šventųjų ligoninėje, tuomet antroje pagal dydį Vokietijos ligoninėje.

1888 m. jis pradėjo nuo Chęcińskio ir Plehno dvigubo dažymo. 1889 m. paruoštame preparate jis pastebėjo, kad plazmodijaus branduolio chromatinas nusidažė kitaip nei citoplazma, tačiau paskui šio rezultato pakartoti nepavyko. Jis bandė rūgštinti metileno mėlynąjį, bet tai tik pablogino padėtį. Pabandė jį šarminti boraksu, ir tai suveikdavo kiekvieną kartą. Metodą jis viešai pademonstravo 1890 m. birželio 15 d., o 1891 m. rugpjūtį paskelbė išsamesnį aprašymą, įskaitant nurodymą naudoti boraksą. Jis pažymėjo, kad dažymas truko dvidešimt keturias valandas, o rezultatus buvo lengva atkurti.

Dvidešimt keturios valandos diagnostikos laboratorijoje yra ilgas laikas, o jo straipsnyje purpuriškai raudonai parazito branduolio spalvai nebuvo skirta daug dėmesio. Kad ir kokia buvo priežastis, niekas nesiėmė sąmoningai šarminti metileno mėlynojo, kol 1898 m. to vėl nepadarė Nochtas. Malachowskis daugiau niekada nerašė apie kraujo dažymą.

Priežastis, kodėl iki pastarojo meto apie jį buvo žinoma taip mažai, slypi archyvuose, o ne paslaptyse. Medicinos literatūroje beveik neišliko jo gyvenimo pėdsakų, o tai, kas išliko, mus pasiekė vienu keliu. Jo dukra Marie 1939 m. išvyko iš Vokietijos į Londoną, tarnavo Britanijos kariuomenėje ir apsigyveno Kanadoje; jos sukaupti šeimos dokumentai galiausiai pateko į Leo Baecko institutą Niujorke. Jos brolis Leo žuvo Pirmajame pasauliniame kare. Jos sesuo Eva 1942 m. balandį buvo deportuota iš Breslau į Izbicos tranzitinę stovyklą ir nebegrįžo. Jos motina Hedwig 1942 m. balandžio 22 d. nusižudė, užuot laukusi tokios pat deportacijos. Malachowskis mirė 1934 m., dar prieš visus šiuos įvykius.

Taip pasibaigianti šeimos istorija yra istorija, kuri nustojama cituoti. Du straipsniai, grąžinę Malachowskį į šio dažymo kūrimo istoriją, abu paskelbti 2011 m., buvo parengti remiantis archyviniais dokumentais Poznanėje ir Vroclave bei Marie dokumentais Niujorke.

Supelijęs buteliukas ir sėkmės sulaukęs rusas

Dmitrijus Romanowskis studijavo mediciną Sankt Peterburgo Karo medicinos akademijoje ir didžiąją karjeros dalį tyrinėjo maliariją. 1890 m. jis paskelbė metodą, kuris aprašyme buvo beveik identiškas Chęcińskio metodui: nepakeistas metileno mėlynasis ir eozinas, tik šiek tiek daugiau eozino.

1891 m. rugsėjį jis paskelbė metodą, kuris jį išgarsino, o svarbiausia detalė buvo paslėpta instrukcijose. Geriausius rezultatus jis gavo naudodamas atsarginį metileno mėlynojo tirpalą – tirpalą, kuris stovėjo daugiau nei du mėnesius ir kurio paviršiuje augo pelėsis. Pelėsis ir ilgas stovėjimas buvo iš dalies demetilinę dažus. Romanowskis to nežinojo ir negalėjo šio proceso kontroliuoti, o kiti tyrėjai, bandę jo metodą, purpurinės spalvos išgauti negalėjo. Jo disertacija Sankt Peterburge buvo pateikta 1891 m. birželį, todėl įprastame istorijos pasakojime atradimo metais laikomi 1891-ieji.

Malachowskis savo metodą buvo pademonstravęs 1890 m. birželį, daugiau nei metais anksčiau, ir jo metodas veikė sąmoningai parinkus sąlygas.

Kodėl dažymas buvo pavadintas ne to žmogaus vardu

Argumentus Malachowskio naudai surinko Kristine Krafts, Ernstas Hempelmannas ir Barbara Oleksyn, ir jie remiasi keturiais dalykais. Viešo demonstravimo data: 1890 m. birželis, palyginti su 1891 m. rugsėju. Žodžiu sąmoningai, palyginti su žodžiu atsitiktinai. Tuo, kad Malachowskis paskelbė savo metodą su visais nurodymais dėl borakso, o Romanowskio metodas priklausė nuo nekontroliuojamo kintamojo. Ir pastebėjimu, kad plazmodijaus branduolio aprašymas kartu su jį išryškinusia purpurine spalva iš esmės septyneriems metams išnyko iš literatūros, nes niekas negalėjo atkurti atsitiktinio varianto.

Savo išvadą jie išsako tiesiai. Biografiniame straipsnyje tokį nuopelnų priskyrimą jie vadina „parodija“ ir cituoja Ralphą Lillie, kuris 1978 m. rašė, kad „galbūt šią dažų šeimą turėtume vadinti Malachowskio dažais“.

Šis teiginys ginčijamas, kaip paprastai būna su pirmenybės teiginiais, ir verta paaiškinti ginčo pobūdį, o ne mėginti jį išspręsti. Ginčijantis dėl pirmenybės būtina apibrėžti, kas buvo atradimas. Jei atradimas yra purpurinė spalva, Malachowskio dokumentuotas demonstravimas buvo ankstesnis. Jei atradimas yra paskelbtas metodas, abu vyrai savo darbus paskelbė 1891 m., o dažymas buvo pavadintas Romanowskio vardu. Jei atradimas yra paaiškinimas, nė vienas negali pretenduoti į pirmenybę, nes nė vienas nežinojo, kad brandinimas yra demetilinimas, ir nė vienas negalėjo paaiškinti, kodėl apskritai atsiranda ši spalva. Būtent šį paskutinį dalyką populiarūs pasakojimai praleidžia. Aktyvusis komponentas buvo priemaiša, kurios niekas nebuvo identifikavęs, o pirmasis žmogus, sąmoningai išgavęs šią spalvą, rėmėsi atkuriamu empiriniu receptu, ne supratimu, ką tas receptas daro.

Du 2011 m. straipsniai yra išsamiausias paskelbtas argumentų Malachowskio naudai išdėstymas, ir abu galima nemokamai skaityti „PubMed“: išsamią apžvalgą – PMID 21235291, o biografinį straipsnį – PMID 21660627. Apžvalgos „PubMed“ įraše taip pat nurodytas jos komentaras, vėliau tais pačiais metais paskelbtas tame pačiame žurnale, 86(5):366. Tai primena, kad vos pasirodę šie argumentai jau buvo ginčijami spaudoje.

Šis ginčas nėra nesutarimas dėl chemijos. Visi jo dalyviai sutaria, kas yra purpurinė spalva ir kurie komponentai ją sukuria. Nesutariama dėl to, kas ją išgavo pirmas, ir dėl to, ar atsitiktinumas, kurio niekas negalėjo pakartoti, apskritai laikytinas pasiekimu.

Ką davė vėliau atsiradę vardai

Jei Malachowskis purpurinę spalvą išgavo pirmas, kodėl dažymas vadinamas Romanowskio, Wrighto ir Giemsos vardais?

Nes dažai, kurie vieną kartą suveikia jų kūrėjo rankose, dar nėra reagentas. Vėlesni darbai kaprizingą mišinį pavertė priemone, kurią kitos šalies laboratorijos technikas galėjo naudoti eilinį antradienį.

Nochtas sprendimą rado samprotaudamas. Nepavykus gauti patikimo rezultato su paprastais neutraliaisiais dažais, jis padarė išvadą, kad purpurinę spalvą turi sukelti kažkas, esantis metileno mėlynajame, bet nesantis pačiu metileno mėlynuoju, ir ėmė to ieškoti. Unna jau buvo pastebėjęs, kad pasenę metileno mėlynojo tirpalai putliųjų ląstelių granules nudažo raudonai, ir iškėlęs mintį, kad dažams bręstant susidaro nauja medžiaga. Bernthsenas 1885 m. buvo parodęs, kad šarminėmis sąlygomis nuo metileno mėlynojo atskeliamos metilo grupės ir kad šie produktai yra tai, ką dabar vadiname azūrais. Nochtas chloroformu ekstrahavo aktyviąją frakciją ir tegalėjo ją pavadinti raudonaisiais dažais iš metileno mėlynojo; Michaelis 1901 m. ją pavadino azūru I. Jenneris išsprendė praktinio naudojimo klausimą. Pakartotinai ištirpinus metileno mėlynojo ir eozino nuosėdas absoliučiajame metanolyje, buvo gautas vienas stabilus tirpalas, kuris dažydamas kartu fiksavo tepinėlį, todėl nebereikėjo fiksuoti karščiu. Leishmanas ir Reuteris sujungė polichrominius dažus su alkoholiniu tirpikliu ir kartu pasiekė stabilumą bei purpurinę spalvą. Wrightas dvylikos valandų inkubaciją 65 °C temperatūroje ir dešimties dienų laikymą pakeitė viena valanda tekančiuose garuose. Giemsa apskritai nustojo kliautis atsitiktinai subrandintu tirpalu: naudojo tiksliai atmatuotus žinomų dažų kiekius ir į metanolį pridėjo glicerolio, kad produktas atlaikytų tropikų karštį. Jis niekada nepaskelbė, kaip gamino gryną metileno azūrą. Jį pardavė dr. Grüblerio laboratorijai Leipcige, kuri prekiavo juo kaip azūru I ir teigė, kad tik jos variantas yra autentiški Giemsos dažai.

Dėl to azūro tapatybės vis dar ginčijamasi. Vieni mano, kad tai buvo tiesiog polichrominis metileno mėlynasis, kiti – kad jame buvo gausu Azure B. Atsakymas paaiškėjo dėl karo. Kai vokiškų dažų nebebuvo galima gauti, Jungtinių Valstijų visuomenės sveikatos tarnybos komanda – Ralphas Lillie, Maurice'as Roe ir Aimee Wilcox – nustatė, kad geriausiai dažo trys atskirti komponentai: nepakeistas metileno mėlynasis, jo demetilintas skilimo produktas Azure B ir eozinas. Azure B pakeitė nebeprieinamą azūrą I, ir šie trys komponentai tebėra šiandien maliarijai diagnozuoti naudojamų dažų pagrindas.

Kaip šie trys komponentai chemiškai sąveikauja ant objektinio stiklelio, yra atskiras klausimas, aptariamas kitame puslapyje. Straipsnyje apie dažų vaidmenis ir Romanowskio tipo dažymo chemiją aiškinama, ką atskirai daro Azure B ir eozinas ir kodėl jų pora suteikia spalvą, kurios nė vienas nesuteikia vienas. Puslapyje apie mikroskopiją ir taikymą laboratorijoje aptariama praktinė pusė: ką parodo konkretus preparatas ir kaip įvertinti, ar konkretus produktas tinka numatytam metodui.

Istorijos dalis, kuri tebėra aktuali

Viena šios istorijos detalė nenustojo būti tiesa 1902 m. Maždaug penkiasdešimt metų svarbiausias pasaulyje standartinio maliarijos dažymo komponentas buvo bevardė priemaiša. Ji atsirasdavo atsitiktinai, jos kiekis skirtinguose buteliukuose skyrėsi, dalį to laikotarpio jos tapatybė buvo komercinė paslaptis, o dėl jos proporcijos ginčytasi iki XX a. penktojo dešimtmečio. Šiuos dažus naudoję žmonės nebuvo aplaidūs. Jie neturėjo galimybės žinoti, kas yra buteliuke.

Šiuolaikinė tos pačios problemos versija yra specifikacija, aprašanti tik dalį medžiagos. Atitiktis USP yra kelias į didžiausią rinkoje siūlomą grynumą, nes tai išsamus paskelbtas standartas, o ne vienas matavimas: tapatybė, grynumas, organinės priemaišos, įskaitant azūro dažus, likutiniai tirpikliai, elementinės priemaišos, kaitinimo liekana, mikrobiologinės ribos ir bakterijų endotoksinai. Blupreme metileno mėlynąjį gauna iš farmacijos gamintojo ir skelbia visą analizės sertifikatą, kad kiekvieną šio sąrašo punktą būtų galima patikrinti, o ne tik juo patikėti. Sertifikatas, kuriame pateikiamas sunkiųjų metalų tyrimo rezultatas ir tai vadinama atitiktimi USP, yra šių dienų buteliuko su etikete „subrandintas metileno mėlynasis“ atitikmuo: galbūt puikus reagentas, tačiau etiketė nepasako, kas jame yra.