E. coli ir kitų kolonijų išvaizdos vertinimas ant EMB agaro

Studentas brūkšniniu būdu pasėja nežinomą mikroorganizmą ant eozino ir metileno mėlynojo agaro, inkubuoja per naktį ir grįžęs randa lėkštelę su tamsiomis, žaliai žvilgančiomis kolonijomis. Užrašuose atsiranda įrašas „E. coli, patvirtinta“. Šiuo įrašu teigiama daugiau, nei galima pagrįsti lėkštelės rezultatu. Lėkštelė parodo augimo ir fermentacijos fenotipą konkrečiomis sąlygomis. Rūšies tapatybė yra atskiras teiginys, kuriam reikia atskirų įrodymų.

Šiame vadove EMB agaro rezultatai nagrinėjami kaip interpretavimo užduotis. Jame paaiškinamas pagrindinis principas, pristatomas iliustracinis lėkštelių atlasas su kontroliniais mėginiais ir aptariami atvejai, kai vadovėlinis vaizdas klaidina.

Lėkštelės veikimo principas

EMB agaras yra ir selektyvioji, ir diferencinė terpė. Dažikliai eozinas Y ir metileno mėlynasis slopina daugelį gramteigiamų mikroorganizmų, todėl terpė palankesnė gramneigiamų mikroorganizmų augimui. Tie patys dažikliai veikia kaip indikatoriai: kai mikroorganizmas fermentuoja terpėje esantį cukrų ir lokaliai pagamina pakankamai rūgšties, kolonija intensyviai sugeria dažiklius ir tampa nuo tamsiai violetinės iki melsvai juodos spalvos. Intensyviai gaminant rūgštį, kolonijos paviršius gali įgyti metalinį žalią vaivorykštinį blizgesį. ASM eozino ir metileno mėlynojo agaro lėkštelių protokole aprašomas šis selektyvumo ir diferencijavimo derinys bei pateikiamos mokymui skirtos etaloninės nuotraukos.

Prieš vertinant bet kokį rezultatą svarbi viena detalė: patikrinkite, kokios sudėties terpė naudojama. Senesnės Holt Harris Teague sudėties terpėje yra laktozės ir sacharozės, o Levine EMB terpėje yra tik laktozės. Mikroorganizmas, fermentuojantis sacharozę, bet ne laktozę, pavyzdžiui, daugelis Serratia marcescens izoliatų, šiose dviejose terpės versijose gali atrodyti skirtingai. Gamintojo EMB terpių dokumentacijoje šis sudėties skirtumas nurodytas aiškiai. Užrašuose kartu su rezultatu nurodykite gamintoją ir terpės sudėtį.

Paruoštas, bet neužsėtas EMB agaras paprastai būna nuo raudonai rudos iki rausvai violetinės spalvos, kartais su žalsvu atspalviu ar smulkiomis nuosėdomis. Ši foninė spalva nėra augimo požymis. Kiekvieną rezultatą lyginkite su neužsėta lėkštele arba dokumentuota pradine terpės išvaizda, o pirminę lėkštelę vertinkite po maždaug 18–24 valandų aerobinio inkubavimo 35–37 C temperatūroje, nebent mokymo protokole nurodyta kitaip. Ilgesnis inkubavimas gali pakeisti fermentacijos požymių išvaizdą.

Kaip apžiūrėti lėkštelę

Naudokite dviejų rūšių apšvietimą. Pirmiausia apžiūrėkite lėkštelę atspindėtoje arba įstrižai krintančioje šviesoje ir ją pakreipkite: metalinis blizgesys yra vaivorykštinis ir, keičiantis žiūrėjimo kampui, gali atsirasti arba išnykti. Tada apžiūrėkite ją praeinančioje šviesoje, kad įvertintumėte kolonijų spalvą ir tamsius centrus. Vertinkite gerai atskirtas kolonijas, nes tankus augimas ir gretimos kolonijos keičia vietinį rūgšties kaupimąsi ir gali susilpninti arba sustiprinti spalvą. ASM vaizdų rinkinyje tai parodyta tiesiogiai: mišrioje kultūroje E. coli gali netekti tikėtino blizgesio, nes aplinkiniai mikroorganizmai pakeičia aplinkos rūgštingumą.

Kai tik užduotis leidžia, įtraukite kontrolinius mėginius. Įprastą mokomąjį rinkinį sudaro E. coli ATCC 25922 melsvai juodos spalvos ir metalinio blizgesio fenotipui, nefermentuojantis mikroorganizmas, pavyzdžiui, Salmonella Typhimurium ATCC 14028 arba Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bespalviam fenotipui ir gramteigiamas mikroorganizmas, pavyzdžiui, Enterococcus faecalis arba Staphylococcus aureus, kaip slopinimo kontrolinis mėginys, kaip nurodyta standartinėse EMB terpių kokybės kontrolės lentelėse. Jei teigiamas kontrolinis mėginys neblizga, prieš abejodami nežinomu mikroorganizmu pirmiausia įtarkite inkubavimo sąlygas, per tankų augimą arba terpės sudėtį.

Iliustracinis lėkštelių atlasas

Toliau pateiktos lėkštelės yra generuotos iliustracijos, o ne tikrų kultūrų nuotraukos. Jos rodo, kokio vaizdo ieškoti, o ne tikslų konkrečios padermės atspalvį. Palyginkite jas su ASM etaloninėmis nuotraukomis ir tikromis mokymo laboratorijos lėkštelėmis.

1 lėkštelė: Escherichia coli ant EMB agaro, intensyviai laktozę fermentuojanti bakterija

E. coli kolonijos ant EMB agaro paprastai būna nuo tamsiai violetinių iki melsvai juodų, dažnai su tamsiu centru ir metaliniu žaliu blizgesiu, atsirandančiu dėl intensyvios rūgšties gamybos. Blizgesys yra gerai žinomas požymis, kurio ieško studentai, tačiau vertinkite jį kaip papildomą įrodymą, o ne apibrėžimą. Blizgesio intensyvumas priklauso nuo padermės, inkubavimo trukmės, kolonijų tankio ir žiūrėjimo kampo. Blizgesio nebuvimas neatmeta E. coli, o tamsi kolonija be blizgesio gali rodyti ir kelias kitas fermentuojančias bakterijas. Tolesniems tyrimams rinkitės gerai atskirtą koloniją, o ne vertinkite tankiai apaugusį sektorių.

2 lėkštelė: Klebsiella pneumoniae ant EMB agaro, gleivingas kolonijas sudaranti fermentuojanti bakterija

Klebsiella pneumoniae ant EMB agaro paprastai sudaro dideles, žvilgančias, gleivingas kolonijas, kurių atspalviai svyruoja nuo rausvai violetinių iki rusvai violetinių. Jos dažnai turi tamsius centrus, tačiau paprastai nepasižymi stipriu metaliniu blizgesiu. Panaši morfologija būdinga ir giminingoms fermentuojančioms bakterijoms, pavyzdžiui, Enterobacter. Gleivinga tekstūra ir kolonijos dydis taip pat svarbūs vertinant: maža ir plokščia rausva kolonija turi kitokią interpretacinę reikšmę nei didelė, išgaubta ir gleivinga. Kaip ir E. coli atveju, lėkštelė leidžia spręsti apie fermentacijos fenotipą, o rūšies nustatymui reikia toliau aprašyto biocheminio patvirtinimo.

3 lėkštelė: Salmonella ant EMB agaro ir kitos nefermentuojančios bakterijos, bespalvės kolonijos

Salmonella ant EMB agaro ir giminingos laktozės nefermentuojančios bakterijos, įskaitant Shigella ir daugelį Pseudomonas izoliatų, paprastai auga kaip bespalvės, permatomos arba šviesiai gintarinės kolonijos. Kai kurios terpės sudėtys ir sąlygos suteikia silpną rausvą atspalvį, todėl šviesiai rausva kolonija savaime nereiškia fermentuojančios bakterijos. EMB neatskiria Salmonella nuo Shigella ar kitų nefermentuojančių bakterijų; šis skirtumas nustatomas vėlesniais tyrimais. Taip pat atkreipkite dėmesį, kad yra dokumentuota laktozę fermentuojančių Salmonella padermių, kurių metaliniu blizgesiu pasižyminčios kolonijos panašios į E. coli. Tai dar viena priežastis, kodėl vienos lėkštelės nepakanka galutinei išvadai.

4 lėkštelė: Serratia marcescens ir terpės sudėties spąstai

Serratia marcescens skiriamas atskiras skyrius, nes studentai dažnai tikisi raudonų kolonijų ir tuomet klaidingai interpretuoja lėkštelę. Dauguma klinikinių izoliatų nefermentuoja laktozės, todėl ant Levine EMB jie dažniausiai atrodo blyškūs arba silpnai nusidažę. Kadangi daugelis izoliatų fermentuoja sacharozę, sacharozės turinčioje terpėje reakcija gali būti tamsesnė arba labiau susijusi su rūgšties susidarymu. 35–37 C temperatūroje taip pat nesitikėkite būdingo raudono prodigiozino pigmento; inkubatoriaus temperatūroje pigmentas gaminamas nepastoviai. Kai protokole minima Serratia marcescens ant EMB agaro, patikrinkite, kokia terpės sudėtis numanoma tame teiginyje. Serratia metabolizmo apžvalgoje apibendrinamas laktozės nefermentavimo ir kintamo sacharozės fermentavimo pobūdis, dėl kurio kyla ši interpretavimo klaida.

5 lėkštelė: kontroliniai mėginiai ir slopinami mikroorganizmai

Gramteigiami mikroorganizmai, tokie kaip Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus ir Bacillus, ant EMB agaro paprastai slopinami arba jų augimas gerokai apribojamas, nors ne visos padermės slopinamos visiškai. Kontrolinių mėginių rinkinys padeda patikimai vertinti rezultatą: E. coli kontrolinis mėginys turėtų gerai augti, būti melsvai juodas ir blizgėti, nefermentuojančio mikroorganizmo kontroliniame mėginyje turėtų augti bespalvės kolonijos, o slopinimo kontroliniame mėginyje augimas turėtų būti menkas arba jo visai neturėtų būti. Jei slopinimo kontrolinis mėginys gerai auga, selektyvumo etapas nepavyko ir visi kiti tos partijos rezultatų vertinimai kelia abejonių. Dažymo metodai atsako į kitą klausimą nei kultivavimo terpės; apie preparatų dažymą laboratorijoje skaitykite metileno mėlynojo dažymo atlase.

Palyginimas ir jo ribos

Klaidinančią išvaizdą apibendrina trys sakiniai. Tamsi spalva nereiškia E. coli, nes Klebsiella, Enterobacter ir kitos fermentuojančios bakterijos suformuoja tamsius centrus be blizgesio. Rausva spalva nereiškia Klebsiella, nes vidutiniškai arba lėtai fermentuojančios bakterijos ir kai kurios paprastai nefermentuojančiomis laikomos bakterijos atrodo rausvos ar šviesiai violetinės. Blizgesys nereiškia galutinai patvirtintos E. coli, nes jį gali sukelti ir kitos intensyviai fermentuojančios bakterijos. Mokymo protokolas ir jame pateikti mišrių kultūrų vaizdai iliustruoja kiekvieną iš šių klaidų.

Patvirtinimo ribos

EMB agaras parodo fenotipą, o ne rūšį. Skirtingų mikroorganizmų kolonijos gali atrodyti vienodai, o to paties mikroorganizmo išvaizda gali nukrypti nuo vadovėlinio vaizdo dėl padermės, kultūros amžiaus, tankaus augimo, terpės sudėties ir inkubavimo. Todėl mokymo ir klinikinėse darbo eigose EMB morfologija laikoma tik preliminariu požymiu.

Pagrįsta studento darbo eiga yra tokia: aprašyti atskirtą koloniją (dydį, spalvą, centrą, blizgesį įstrižai krintančioje šviesoje, gleivingumą), užrašyti terpės sudėtį, inkubavimo trukmę ir temperatūrą bei kontrolinių mėginių rezultatus; tada, prieš atliekant bet kokį patvirtinamąjį tyrimą, persėti gerai atskirtą koloniją ir išauginti gryną kultūrą. Įprasti tolesni tyrimai apima dažymą Gramo būdu ir IMViC reakcijas preliminariam E. coli bei koliforminių bakterijų identifikavimui, TSI arba KIA ir konkretiems mikroorganizmams skirtus biocheminių tyrimų rinkinius žarnyno mikroorganizmams, o prireikus pagal užduotį – serologinį, MALDI TOF ar kitą validuotą identifikavimą. Norėdami suprasti EMB vietą tarp selektyviųjų ir diferencinių žarnyno mikroorganizmų terpių, žr. įvadinę medžiagą apie žarnyno mikroorganizmų kultivavimo terpes ir tolesnius tyrimus po dažymo Gramo būdu. Susijusį klausimą, ką mėlynai nudažytas preparatas gali ir ko negali įrodyti, aptaria metileno mėlynojo dažymo atlasas, kuriame taip pat aiškiai atskiriamas stebėjimas nuo išvados.

Prieš išvadą užrašykite stebėjimą. „Tamsios melsvai juodos kolonijos su nuo žiūrėjimo kampo priklausančiu žaliu blizgesiu ant Levine EMB po 24 valandų, atitinkančios intensyvią laktozės fermentaciją“ yra pagrįstas teiginys. „E. coli, patvirtinta“ reikalauja patvirtinimo etapo, kurio vien lėkštelė suteikti negali.