ບົດຄວາມ
ເມທີລີນບລູ ແລະ ຈຸລິນຊີໃນລຳໄສ້: ການສຶກສາໃນໜູສະແດງຫຍັງ

ເມທີລີນບລູສາມາດປ່ຽນອົງປະກອບຂອງແບັກທີເຣຍທີ່ວັດໄດ້ໃນອາຈົມໜູ. ຂໍ້ຄົ້ນພົບນັ້ນບໍ່ໄດ້ຢືນຢັນວ່າມັນຊ່ວຍໃຫ້ສຸຂະພາບລຳໄສ້ຂອງມະນຸດດີຂຶ້ນ, ກຳຈັດແບັກທີເຣຍທີ່ເປັນອັນຕະລາຍແບບຈຳເພາະ ຫຼື ຮັກສາພາວະຈຸລິນຊີເສຍສົມດຸນ. ຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນແມ່ນລະຫວ່າງການປ່ຽນຊຸມຊົນຈຸລິນຊີ ກັບ ການເຮັດໃຫ້ສຸຂະພາບຂອງສິ່ງມີຊີວິດທີ່ຈຸລິນຊີນັ້ນອາໄສຢູ່ດີຂຶ້ນ.
ການທົດລອງໃນໜູທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຄຳຖາມນີ້ໂດຍກົງທີ່ສຸດໄດ້ວັດ DNA ຂອງແບັກທີເຣຍ ແລະ ຜົນການທົດສອບເຂົາວົງກົດ. ການວັດເຫຼົ່ານີ້ສາມາດລະບຸຮູບແບບທີ່ຄວນສຶກສາຕໍ່. ແຕ່ໂດຍລຳພັງແລ້ວ ມັນບໍ່ສາມາດຢືນຢັນໄດ້ວ່າການປ່ຽນແປງຂອງແບັກທີເຣຍເປັນສາເຫດໃຫ້ພຶດຕິກຳປ່ຽນແປງ ຫຼື ວ່າການປ່ຽນແປງຢ່າງໃດຢ່າງໜຶ່ງຈະບົ່ງບອກວ່າອາການຂອງລະບົບຍ່ອຍອາຫານຈະບັນເທົາລົງ.
ນັກວິຈັຍໄດ້ວັດຫຍັງແທ້ໆ
ໃນການທົດລອງປີ 2020 ຂອງ Gureev ແລະ ຄະນະ, ໜູ C57Bl/6 ອາຍຸສາມເດືອນໄດ້ຮັບເມທີລີນບລູເປັນເວລາສີ່ອາທິດ ໃນປະລິມານ 15 mg/kg/day (ໜູເກົ້າໂຕ), 50 mg/kg/day (ແປດໂຕ) ຫຼື ນ້ຳສຳລັບກຸ່ມຄວບຄຸມ (13 ໂຕ). ພາກການອອກແບບການທົດລອງບໍ່ໄດ້ລະບຸຢ່າງຊັດເຈນວ່າໃຫ້ຢາຜ່ານຊ່ອງທາງໃດ ຫຼື ສັດເປັນເພດໃດ.
ໄດ້ເກັບຕົວຢ່າງອາຈົມກ່ອນໃຫ້ສານ ແລະ ທຸກອາທິດ. ນັກວິຈັຍໃຊ້ qPCR ສຳລັບກຸ່ມແບັກທີເຣຍ ແລະ ການຫາລຳດັບຂອງຊິ້ນສ່ວນ DNA 16S ທີ່ເພີ່ມຈຳນວນແລ້ວເປັນການເສີມ. ໃນຫ້າມື້ສຸດທ້າຍ ໜູໄດ້ຝຶກໃຫ້ຄຸ້ນເຄີຍສອງມື້ ແລ້ວຕາມດ້ວຍການທົດສອບເຂົາວົງກົດຮູບ T ແບບມີລາງວັນສາມມື້ ໂດຍໃຫ້ຄະແນນການເລືອກສິບຄັ້ງຕໍ່ມື້.
ນີ້ແມ່ນການໃຫ້ສານແກ່ໜູໃນການທົດລອງ ບໍ່ແມ່ນຄຳແນະນຳປະລິມານໃຊ້ສຳລັບມະນຸດ. ຊ່ອງທາງການໃຫ້ຢາມີຄວາມສຳຄັນເມື່ອຕີຄວາມວ່າຢາໄປເຖິງລຳໄສ້ຫຼາຍປານໃດ ແລະ ຖ້າບໍ່ໄດ້ລະບຸຊ່ອງທາງໄວ້ ກໍບໍ່ຄວນສັນນິຖານຂຶ້ນເອງ. ການປ່ຽນຄ່າຕາມນ້ຳໜັກຮ່າງກາຍບໍ່ສາມາດຢືນຢັນແນວທາງການໃຊ້ທີ່ປອດໄພ ຫຼື ໄດ້ຜົນສຳລັບມະນຸດ.
ຕາຕະລາງຫຼັກຖານຈາກການສຶກສາຈຸລິນຊີ
ຕາຕະລາງທີ່ຈັດເຮັດຂຶ້ນສຳລັບບົດຄວາມນີ້ແຍກຂໍ້ສັງເກດທີ່ລາຍງານໄວ້ອອກຈາກຄຳອ້າງເພີ່ມເຕີມທີ່ຜູ້ອ່ານອາດພົບ. ຊື່ກຸ່ມແບັກທີເຣຍໃຊ້ຕາມຄຳສັບໃນບົດວິຈັຍ.
| ດ້ານຂອງຫຼັກຖານ | ຂໍ້ສັງເກດ ຫຼື ການວັດ | ຂໍ້ຈຳກັດໃນການຕີຄວາມ |
|---|---|---|
| ອົງປະກອບແບັກທີເຣຍໃນກຸ່ມທີ່ໄດ້ຮັບສານໜ້ອຍກວ່າ | ທີ່ 15 mg/kg/day, ບາງກຸ່ມທີ່ກວດມີການປ່ຽນແປງ; Delta/Gammaproteobacteria ເພີ່ມຂຶ້ນໃນຊ່ວງຕົ້ນ ແລະ ກວດບໍ່ພົບໃນອາທິດທີສີ່. | ຕົວຢ່າງທີ່ເກັບໃນຈຸດສິ້ນສຸດອາດບໍ່ສະແດງການປ່ຽນແປງກ່ອນໜ້ານັ້ນ. ການກວດບໍ່ພົບຂຶ້ນກັບວິທີກວດ. |
| ອົງປະກອບແບັກທີເຣຍໃນກຸ່ມທີ່ໄດ້ຮັບສານຫຼາຍກວ່າ | ທີ່ 50 mg/kg/day, ຄ່າມັດທະຍະຖານຂອງ Proteobacteria ໃນອາທິດທີສີ່ແມ່ນ 7.49%, ທຽບກັບ 1.61% ໃນກຸ່ມຄວບຄຸມ. | ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງເປີເຊັນບໍ່ໄດ້ຢືນຢັນວ່າຈຳນວນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດເພີ່ມຂຶ້ນໃນຄ່າສົມບູນ. |
| ລາຍລະອຽດທາງອະນຸກົມວິທານ | ການຫາລຳດັບ DNA ລະບຸການປ່ຽນແປງພາຍໃນກຸ່ມແບັກທີເຣຍລະດັບກວ້າງ. | ປະລິມານລວມຂອງໄຟລຳທີ່ຄົງທີ່ອາດປິດບັງການປ່ຽນແປງຂອງສະມາຊິກພາຍໃນກຸ່ມ. |
| ພຶດຕິກຳຂອງສັດເຈົ້າບ້ານ | ການໄດ້ຮັບສານໜ້ອຍກວ່າເຮັດໃຫ້ຄະແນນລວມຂອງເຂົາວົງກົດຮູບ T ດີຂຶ້ນ; ການໄດ້ຮັບສານຫຼາຍກວ່າບໍ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ດີຂຶ້ນ. | ນີ້ແມ່ນຜົນການເຮັດກິດຈະກຳສະເພາະຢ່າງໜຶ່ງ ບໍ່ແມ່ນການປະເມີນຄວາມສາມາດດ້ານການຮູ້ຄິດຢ່າງຮອບດ້ານ. |
| ຄວາມສຳພັນ | Deferribacteres ມີຄວາມສຳພັນທາງລົບກັບຄະແນນໃນມື້ທີສອງ. | ຄວາມສຳພັນບໍ່ໄດ້ລະບຸສິ່ງມີຊີວິດ ຫຼື ກົນໄກທີ່ເປັນສາເຫດ. |
| ການເຮັດວຽກຂອງລຳໄສ້ | ບໍ່ມີຕົວຊີ້ວັດໂດຍກົງກ່ຽວກັບແນວກັ້ນຂອງລຳໄສ້ ຫຼື ສານທີ່ເກີດຈາກການເຜົາຜານ. | ການສຶກສານີ້ບໍ່ສາມາດຢືນຢັນວ່າຄວາມສາມາດໃນການຊຶມຜ່ານໄດ້ຮັບການຟື້ນຟູ ຫຼື ການເຮັດວຽກຂອງຈຸລິນຊີດີຂຶ້ນ. |
| ການທົດສອບເຫດແລະຜົນ | ບໍ່ມີການທົດລອງຖ່າຍໂອນ ຫຼື ຫຼຸດຈຳນວນຈຸລິນຊີ. | ຍັງບໍ່ຮູ້ວ່າຈຸລິນຊີເປັນຕົວກາງຂອງຜົນຕໍ່ພຶດຕິກຳຫຼືບໍ່. |
ຕາຕະລາງນີ້ຕັ້ງໃຈແບ່ງຕາມສິ່ງທີ່ໄດ້ວັດ. ຄຳຕອບທີ່ເປັນບວກໃນແຖວໜຶ່ງບໍ່ສາມາດເຕີມຄຳຕອບທີ່ຂາດຫາຍໃນອີກແຖວໜຶ່ງໄດ້. ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ ຜົນການທົດສອບເຂົາວົງກົດທີ່ດີຂຶ້ນບໍ່ໄດ້ທົດແທນຫຼັກຖານທີ່ຂາດຫາຍກ່ຽວກັບການອັກເສບໃນລຳໄສ້.
ເປັນຫຍັງເປີເຊັນຂອງແບັກທີເຣຍຈຶ່ງບໍ່ບອກວ່າຫຍັງຖືກຂ້າ
ຄຳວ່າ ຄວາມອຸດົມສົມບູນແບບສຳພັດ ໝາຍເຖິງສັດສ່ວນຂອງກຸ່ມໜຶ່ງໃນຊຸມຊົນທີ່ວັດໄດ້. ມັນແຕກຕ່າງຈາກຈຳນວນຈຸລັງແບັກທີເຣຍຕໍ່ອາຈົມໜຶ່ງກຣາມ. ໃນການສຶກສາອົງປະກອບຈຸລິນຊີແບບປະລິມານຂອງພວກເຂົາ, Vandeputte ແລະ ຄະນະ ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເປັນຫຍັງປະລິມານຈຸລິນຊີລວມຈຶ່ງສຳຄັນເມື່ອຕີຄວາມຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງຊຸມຊົນ.
ລອງພິຈາລະນາຕົວຢ່າງສົມມຸດທີ່ມີສິ່ງມີຊີວິດ A ສິບໜ່ວຍ ແລະ ສິ່ງມີຊີວິດອື່ນໆ 90 ໜ່ວຍ. A ຄິດເປັນ 10%. ຖ້າ A ຍັງຄົງຢູ່ສິບໜ່ວຍ ແຕ່ກຸ່ມອື່ນຫຼຸດລົງເຫຼືອ 40, ຕອນນີ້ A ຈະຄິດເປັນ 20%. ສັດສ່ວນຂອງມັນເພີ່ມເປັນສອງເທົ່າ ໂດຍທີ່ປະລິມານສົມບູນຂອງມັນບໍ່ໄດ້ເພີ່ມຂຶ້ນເລີຍ. ຕົວຢ່າງການຄຳນວນນີ້ບໍ່ແມ່ນຜົນຈາກການທົດລອງເມທີລີນບລູ.
ຄວາມແຕກຕ່າງດຽວກັນນີ້ກໍຈຳກັດຄຳອ້າງກ່ຽວກັບການຂ້າແບັກທີເຣຍ. ສັດສ່ວນທີ່ອີງໃສ່ DNA ບໍ່ແມ່ນການທົດສອບການຢູ່ລອດໂດຍກົງ. ເພື່ອຢືນຢັນການຫຼຸດລົງຂອງແບັກທີເຣຍທີ່ຍັງມີຊີວິດ ການທົດລອງຕ້ອງມີການວັດທີ່ປະເມີນການມີຊີວິດ ແລະ ຄຳນຶງເຖິງຈຳນວນລວມທັງໝົດ. ເພື່ອຢືນຢັນການປ່ຽນແປງດ້ານການເຮັດວຽກ ຈຳເປັນຕ້ອງມີການວັດການເຮັດວຽກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ ເຊັ່ນ ການວັດສານທີ່ເກີດຈາກການເຜົາຜານ ແທນການຄາດຄະເນຈາກຊື່ແບັກທີເຣຍພຽງຢ່າງດຽວ.
ການໃຊ້ຊື່ກຸ່ມລະດັບກວ້າງຍັງປິດບັງຄວາມຫຼາກຫຼາຍທາງຊີວະວິທະຍາ. ການມອງວ່າທັງໄຟລຳເປັນປະໂຫຍດ ຫຼື ເປັນອັນຕະລາຍ ແມ່ນການຂ້າມລາຍລະອຽດຂອງສິ່ງມີຊີວິດ ແລະ ກິດຈະກຳທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນສະເພາະນັ້ນ. ດັ່ງນັ້ນ ການປ່ຽນແປງຂອງອັດຕາສ່ວນພຽງຢ່າງດຽວຈຶ່ງບໍ່ແມ່ນການວິນິດໄສພາວະຈຸລິນຊີເສຍສົມດຸນ ຫຼື ຫຼັກຖານວ່າພາວະນັ້ນໄດ້ຮັບການຮັກສາແລ້ວ.
ຈຸລິນຊີອະທິບາຍຜົນການທົດສອບເຂົາວົງກົດໄດ້ບໍ?
ການທົດລອງໄດ້ນຳການໄດ້ຮັບຢາ, ອົງປະກອບແບັກທີເຣຍ ແລະ ພຶດຕິກຳມາສຶກສາຮ່ວມກັນ. ນີ້ມີປະໂຫຍດຕໍ່ການສ້າງສົມມຸດຕິຖານ. ການຕີຄວາມຂອງພວກເຮົາແມ່ນ ການອອກແບບນີ້ບໍ່ສາມາດແຍກຄຳອະທິບາຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ຫຼາຍຢ່າງອອກຈາກກັນ: ຜົນໂດຍກົງຂອງຢາຕໍ່ພຶດຕິກຳ, ຜົນທາງອ້ອມຜ່ານຈຸລິນຊີ ຫຼື ການທີ່ພຶດຕິກຳແລະແບັກທີເຣຍຕອບສະໜອງແຍກກັນຕໍ່ການໄດ້ຮັບສານດຽວກັນ.
ການທົດລອງບົດບາດຕົວກາງທີ່ເຂັ້ມແຂງກວ່າ ຈະຕ້ອງປ່ຽນຈຸລິນຊີທີ່ສົມມຸດວ່າເປັນຕົວກາງໂດຍບໍ່ຂຶ້ນກັບຢາ. ນັກວິຈັຍອາດທົດສອບວ່າການຖ່າຍໂອນຊຸມຊົນຈຸລິນຊີທີ່ກຳນົດໄວ້ສາມາດຖ່າຍໂອນຜົນນັ້ນໄດ້ຫຼືບໍ່ ຫຼື ວ່າການກຳຈັດເສັ້ນທາງການເຮັດວຽກຂອງຈຸລິນຊີທີ່ສົມມຸດໄວ້ສາມາດປ້ອງກັນຜົນນັ້ນໄດ້ຫຼືບໍ່. ການທົດລອງແບບນີ້ຍັງຕ້ອງຄວບຄຸມສິ່ງອື່ນໆທີ່ຖືກຖ່າຍໂອນ ຫຼື ປ່ຽນແປງໄປນຳ.
ຕົວຊີ້ວັດດ້ານພຶດຕິກຳກໍຕ້ອງອ່ານຢ່າງລະມັດລະວັງເຊັ່ນກັນ. ເຂົາວົງກົດແບບມີລາງວັນໃຫ້ສັດເລືອກພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂສະເພາະ. ຕາມຫຼັກການປະເມີນ ຜົນການເຮັດກິດຈະກຳອາດຂຶ້ນກັບຄວາມຢາກສຳຫຼວດ, ການເຄື່ອນໄຫວ, ແຮງຈູງໃຈຈາກລາງວັນ ແລະ ການຮຽນຮູ້. ການເອີ້ນຜົນນັ້ນວ່າ “ຄວາມສາມາດດ້ານການຮູ້ຄິດດີຂຶ້ນ” ເປັນການລວບລວມຄວາມແຕກຕ່າງເຫຼົ່ານີ້ເຂົ້າກັນ. ການອະທິບາຍກິດຈະກຳທີ່ວັດໂດຍກົງຍັງຄົງໃຫ້ຂໍ້ມູນທີ່ຊັດເຈນກວ່າ.
ເມທີລີນບລູຂ້າແບັກທີເຣຍໃນລຳໄສ້ບໍ?
ເມທີລີນບລູສາມາດມີສ່ວນໃນການຕ້ານຈຸລິນຊີພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຫ້ອງທົດລອງທີ່ກຳນົດໄວ້. ນັ້ນບໍ່ໄດ້ບອກວ່າຈະເກີດຫຍັງຂຶ້ນກັບຊຸມຊົນຈຸລິນຊີທັງໝົດໃນລຳໄສ້ຫຼັງຈາກໄດ້ຮັບສານທາງປາກ.
ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ ການສຶກສາໃນຫ້ອງທົດລອງກ່ຽວກັບການເຮັດໃຫ້ແບັກທີເຣຍໝົດລິດດ້ວຍສານໄວແສງແລະແສງໄດ້ທົດສອບ E. coli ແລະ S. aureus ດ້ວຍສານໄວແສງ ແລະ ການສ່ອງແສງທີ່ຄວບຄຸມໄວ້. ການສຶກສານີ້ປະເມີນການເກີດໂຄໂລນີ ແລະ ຄວາມເສຍຫາຍຕໍ່ເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ ແລະ ມີກຸ່ມຄວບຄຸມໃນຄວາມມືດທີ່ສອດຄ່ອງກັນ. ແສງພຽງຢ່າງດຽວ ຫຼື ສານໄວແສງພຽງຢ່າງດຽວບໍ່ມີຜົນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ທົດສອບນັ້ນ.
ກຸ່ມຄວບຄຸມເຫຼົ່ານັ້ນຕອບຄຳຖາມສຳຄັນດ້ານເຫດແລະຜົນພາຍໃນການທົດລອງນັ້ນ: ການໃຊ້ທັງສອງຮ່ວມກັນມີສ່ວນເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນແນວໃດ? ການກືນສານບໍ່ໄດ້ສ້າງສະພາບດຽວກັບການສ່ອງແສງໃສ່ຂອງແຫຼວທີ່ມີແບັກທີເຣຍແຂວນລອຍຢູ່. ໃນທາງກັບກັນ ການບໍ່ພົບຜົນໃນກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ຢູ່ໃນຄວາມມືດ ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນແລະໄລຍະເວລາໜຶ່ງ ບໍ່ໄດ້ພິສູດວ່າການໄດ້ຮັບສານໂດຍບໍ່ມີແສງທຸກກໍລະນີຈະບໍ່ມີລິດທາງຊີວະວິທະຍາ. ພາບລວມການວິຈັຍດ້ານການຕ້ານຈຸລິນຊີອະທິບາຍຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ຂຶ້ນກັບເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້.
ການສຶກສາຊຸມຊົນຈຸລິນຊີໃນລຳໄສ້ກໍບໍ່ສາມາດຢືນຢັນການຮັກສາການຕິດເຊື້ອສະເພາະຢ່າງໜຶ່ງໄດ້. ການລະບຸເຊື້ອ ແລະ ການສະແດງຜົນທາງຄລີນິກທີ່ເໝາະສົມແມ່ນວຽກຄົນລະສ່ວນ ລວມທັງເວລາປະເມີນຄຳອ້າງກ່ຽວກັບການຮັກສາປາຣາສິດ.
ນີ້ໝາຍຄວາມວ່າແນວໃດຕໍ່ຄຳອ້າງດ້ານສຸຂະພາບລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ
ການຄົ້ນຫາເອກະສານວິຊາການທີ່ມຸ່ງເນັ້ນປະເດັນນີ້ສຳລັບບົດຄວາມ ບໍ່ພົບການທົດລອງຈຸລິນຊີໃນລຳໄສ້ຂອງມະນຸດແບບມີກຸ່ມຄວບຄຸມ ທີ່ຢືນຢັນປະໂຫຍດຕໍ່ສຸຂະພາບລຳໄສ້ຈາກເມທີລີນບລູ. ນີ້ແມ່ນຂໍ້ຄວາມກ່ຽວກັບຫຼັກຖານທີ່ຄົ້ນພົບ ບໍ່ແມ່ນຫຼັກພິສູດວ່າບໍ່ມີການສຶກສາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງເລີຍ. ການວິຈັຍໃນມະນຸດກ່ຽວກັບການຮັກສາສະເພາະບ່ອນໃນຊ່ອງປາກດ້ວຍສານໄວແສງແລະແສງ ເປັນອີກຄຳຖາມໜຶ່ງ: ຕົວຢ່າງເຊັ່ນ ການທົດລອງກ່ຽວກັບກິ່ນປາກໃນ 45 ຄົນໄດ້ເກັບຕົວຢ່າງຄາບຝ້າລີ້ນ ແລະ ວັດກາສໃນລົມຫາຍໃຈ ບໍ່ແມ່ນສຸຂະພາບລຳໄສ້.
ເພື່ອສະໜັບສະໜູນຄຳອ້າງດ້ານສຸຂະພາບລຳໄສ້ຂອງມະນຸດ ການສຶກສາຈະຕ້ອງມີກຸ່ມປະຊາກອນທີ່ກຳນົດຊັດເຈນ, ສູດຕຳຮັບແລະຊ່ອງທາງການໃຫ້ທີ່ສາມາດເຮັດຊ້ຳໄດ້, ສິ່ງປຽບທຽບທີ່ເໝາະສົມ ແລະ ຜົນລັບທີ່ມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ກຸ່ມປະຊາກອນນັ້ນ. ອົງປະກອບຈຸລິນຊີອາດຊ່ວຍອະທິບາຍຜົນລັບໄດ້ ແຕ່ກໍຍັງຕ້ອງປະເມີນການດີຂຶ້ນຂອງອາການ, ການຄວບຄຸມພະຍາດ ແລະ ຜົນບໍ່ພຶງປະສົງ.
ສີ່ອາທິດໃນແບບຈຳລອງໜູພຽງແບບດຽວກໍບໍ່ສາມາດຢືນຢັນຜົນທີ່ຈະເກີດຈາກການໃຊ້ເປັນເດືອນ ຫຼື ເປັນປີໄດ້. ບົດທົບທວນກ່ຽວກັບການໄດ້ຮັບເມທີລີນບລູທຸກມື້ແລະໄລຍະຍາວແຍກໄລຍະເວລາການໃຫ້ສານອອກຈາກການຕິດຕາມສັງເກດ ແລະ ຕົວຊີ້ວັດດ້ານຄວາມປອດໄພ. ສຳລັບບໍລິບົດທາງຄລີນິກທີ່ກວ້າງຂຶ້ນ ໃຫ້ອ່ານສິ່ງທີ່ການວິຈັຍໃນມະນຸດສະໜັບສະໜູນ.