Wéi Methylenblo an Zelle gelaangt: Reduktioun, Reoxidatioun, Opnam

Wann ee kuckt, wéi Endothelzellen an enger Kulturschuel Methylenblo ophuelen, läit eng Interpretatioun op der Hand, déi awer falsch ass. D'Medium verléiert seng blo Faarf, d'Zelle kréie blo Granulen, also misst de Faarfstoff als blo Moleküll duerch d'Membran gaange sinn. D'Experimenter weisen eppes anescht. Déi blo Form kënnt kaum duerch. Et ass déi faarflos Form, déi passéiert, an dat Blot, dat ee bannen gesäit, entsteet eréischt bannen, no der Opnam.

Dës ëmgedréint Perspektiv ass wichteg, well si bestëmmt, wat eng Fierwung verrode kann a wat net. Blo Granule weisen oxidéierte Faarfstoff un, deen an Organellen nees oxidéiert a festgehale gouf. Si weisen net de ganze Faarfstoff an der Zell un, si weisen net de reduzéierte Bestand un, a si moossen net de biologeschen Effekt. Fir ze verstoen, firwat dat esou ass, muss een déi dräi Schrëtt verfollegen: Reduktioun op der Uewerfläch, Diffusioun vun der reduzéierter Form, Reoxidatioun a Festhale bannen.

Déi zwou Forme behuele sech wéi verschidde Moleküllen

Oxidéierte Methylenblo ass e flaacht, positiv geluedent Ranksystem. E léist sech am Waasser op, absorbéiert staark Liicht am Beräich vu 600 bis 700 nanometers a gesäit blo aus. D'Laascht ass den entscheedende Punkt. E geluedent, waasserfrëndlecht Moleküll kënnt net einfach duerch eng Lipidmembran. Dofir schwätzt d'Literatur virsiichteg vu relativ membranonduerchlässeg, net vun onduerchlässeg.

Reduzéierte Methylenblo, Leukomethylenblo genannt, ass faarflos, ongelueden a fettléislech. Wann d'Laascht ewechfält, ass d'Membran keng Mauer méi. Dat reduzéiert Moleküll diffuséiert liicht doduerch. Wann et bannen an e méi oxidéierend Kompartiment kënnt, kann et nees Elektronen ofginn an an déi blo, gelueden, festgehale Form zeréckgoen. D'Redoxchimie vum Faarfstoff ass also och säin Transportmechanismus. Wann d'Zuel vun den Elektrone geännert gëtt, ännert sech och d'Duerchlässegkeet.

D'Elektrone fir den éischte Schrëtt kommen aus der Zell selwer. Mamendéierenzellen transportéieren Elektronen duerch d'Plasmamembran a féiere Reduktiounsequivalente vun intrazellulären Donateuren no baussen un Akzeptoren op der Uewerfläch. Dës Aktivitéit iwwer d'Plasmamembran ass eng normal Zellfunktioun, déi an de meeschten Zellzorte virkënnt. Déi endothelial Uewerflächereduktase, déi Thiazin-Faarfstoffer reduzéiert, verhält sech an engem opschlossräiche Punkt wéi aner Reduktasen: Si schafft och a Presenz vu Cyanid an Azid weider, bei Dosen, déi déi spéider Schrëtt ausschalten. Dës Trennung ass den entscheedende Punkt vun der ganzer Geschicht.

D'Verdeelung tëscht Phase koum fir d'éischt an huet d'Opnam bal erkläert

1929 huet d'Marian Irwin um Rockefeller Institute eng méi einfach Fro gestallt. Vläicht besteet d'Opnam vum Faarfstoff nëmmen an enger Verdeelung tëscht Waasser an de fetthaltege Schichte vun der Zell, an eng Chloroformschicht kéint am Laboratoire dës fetthalteg Schichte vertrieden. Fir hir spektrophotometresch Penetratiounsstudien huet si wässerlech Faarfstoffléisunge mat Chloroform gerëselt a verglach, wat an déi organesch Phas iwwergaangen ass a wat a lieweg Algezelle koum.

Zwou Erkenntnesser aus där Aarbecht verdéngen nach ëmmer Opmierksamkeet. Éischtens hunn handelsüblech Methylenbloléisungen Trimethylthionin enthale, haut azure B genannt. Dës Veronrengegung ass méi séier agedronge wéi Methylenblo selwer, besonnesch bei alkaleschem pH, wou déi lipidléislech Form vun der fräier Base dominéiert. Verschidden anscheinend Opname vu Methylenblo waren a Wierklechkeet eng selektiv Opnam vun azure B. Zweetens huet de pH d'Resultat bestëmmt, andeems en den Ionisatiounszoustand festgeluecht huet, a beschiedegt Zellen hu vill méi Faarfstoff eragelooss wéi intakt Zellen. Verdeelungskoeffizienten a Laaschtzoustand hu bestëmmt, wat de kënschtleche System a wat déi lieweg Zell jeeweils opgeholl hunn. D'Änlechkeet tëscht deenen zwee huet d'Iddi vun netwässerleche Schichten an der Zellgrenz ënnerstëtzt.

De Modell war viraussiichtlech, wat Lipiden an Ionisatioun ugeet. E konnt awer net ënnerscheeden tëscht engem Faarfstoff, dee sech a senger eegener Form verdeelt, an engem Faarfstoff, deen op der Uewerfläch chemesch ëmgewandelt gëtt, an enger anerer Form passéiert an bannen nees zeréckëmgewandelt gëtt. Fir dësen Ënnerscheed ze weisen, war en anert Experiment néideg. Dat koum siwwenzeg Joer méi spéit, um Endothel vun de Longen.

Reduktioun baussen, Festhale bannen

De Merker a seng Kolleegen hu mat kultivéierten Endothelzellen aus de Longenarterie vu Ranner geschafft an eng Sequenz aus dräi Schrëtt virgeschloen: Den oxidéierte Faarfstoff gëtt op der Zelluewerfläch zu senger faarfloser, lipophiler Form reduzéiert, déi reduzéiert Form diffuséiert eran, an déi intrazellulär Reoxidatioun stellt déi membranonduerchlässeg oxidéiert Form nees hier, déi sech dann usammelt. Hir Studie iwwer d'Opnam vun Thiazin duerch Endothelzellen huet dës Sequenz getest, andeems si probéiert hunn, se op bestëmmte Plazen z'ënnerbriechen.

Dat éischt Instrument war Ferricyanid, en Elektronenakzeptor, deen net an d'Zell erakënnt. Wann Uewerflächenenzyme baussent der Zell de bloe Faarfstoff a seng faarflos Form reduzéieren, kann Ferricyanid déi Elektronen nees ofhuelen. Doduerch entsteet nees bloe Faarfstoff am Medium, éier en iwwerhaapt d'Membran passéiert. Soulaang Ferricyanid am Iwwerschoss do war (10 micromolar Faarfstoff géintiwwer 50 bis 500 micromolar Ferricyanid), ass d'Opnam vum Faarfstoff bal zum Stëllstand komm. Eréischt nodeems de Ferricyanid verbraucht war, ass d'Opnam nees mat hirer normaler Vitess weidergaangen. D'Kinetik huet déiselwecht Geschicht op eng zweet Aart erzielt. Ferricyanid ass mat enger ongeféier konstanter Vitess verschwonnen, wat zu engem stännege Reduktiounsfloss op der Uewerfläch passt, deen e recycléierbare Mediateur versuergt huet. Den extrazelluläre Faarfstoff dogéint ass exponentiell verschwonnen, wéi säi Bestand ofgeholl huet. E konstante Floss zesumme mat engem ofhuelende Bestand bedeit, datt d'Ferricyanidsignal eng kontinuéierlech Reduktioun uweist, an net Faarfstoffmoleküllen, déi d'Léisung verloossen.

Dat zweet Instrument huet de Schrëtt vum Membranpassage ganz ausgeschloss. D'Grupp huet Toluidinblo O, e Faarfstoff, deen enk mat den Thiazine verwannt ass, un eng grouss Polyacrylamidkette gebonnen. Déi war ze grouss, fir an engem vun deenen zwee Oxidatiounszoustänn an d'Zell eranzekommen. D'Zellen hunn de gebonnene Faarfstoff trotzdeem reduzéiert. Fir d'Reduktioun ass also keen intrazellulären Zougang néideg. De verantwortlechen Apparat läit op der Uewerfläch fräi oder ass elektresch mat hir gekoppelt.

Du koum déi Trennung, déi der Publikatioun hiren Titel gëtt. Cyanid an Azid bei 2 millimolar hunn d'Usammlung vum Faarfstoff staark ënnerdréckt. Ënnert dem Mikroskop waren déi donkelblo a mof Aschlëss, déi normalerweis ronderëm de Kär leien, bal komplett verschwonnen. Awer keen vun deenen zwee Hemmstoffer huet déi extrazellulär Reduktioun verlangsamt: De Ferricyanidzyklus ass onvermënnert weidergaangen, an den netduerchdréngende Polymer gouf nach ëmmer reduzéiert. D'Blockad louch méi spéit an der Sequenz. Cyanid an Azid hunn déi intrazellulär Reoxidatioun an d'Festhale gestoppt, net d'Reduktioun op der Uewerfläch. Viabilitéitskontrollen hunn dës Interpretatioun gestäipt: D'Zellen hunn hiert zytosolescht Markerenzym Laktatdehydrogenase wärend dëse Behandlunge behalen. De Verloscht vun der Opnam war also net einfach op eng Vergëftung oder e Broch vun der Membran zeréckzeféieren.

Eng Aschränkung aus der Publikatioun gëllt nach ëmmer. Déi blo Aschlëss louche ronderëm de Kär, awer net am Kär. Dat passt zu enger Oxidatioun a subzellulären Organellen, mee d'Studie huet net festgestallt, wéi eng Organellen et waren. Änlech Musteren an aneren Zellzorte waren op schwaacher Beweisgrondlag als lysosomal bezeechent ginn. D'Festhale kann een als nogewisen ugesinn, déi genee Plaz awer nëmmen als provisoresch. Wien verfollege wëll, wou d'Elektronen duerno higinn, kann iwwer mitochondrialen Elektronentransport a Redoxprozesser an dat méi breet Bild vun der Absorptioun a Verdeelung no Opnamwee weiderliesen.

Fierwung ass net Expositioun

Eng drëtt Studie weist, wat geschitt, wann dës Opnamlogik op eng biologesch Moossgréisst trëfft. De Scott a seng Kolleegen hu festgestallt, datt Methyl-Beta-Cyclodextrin, e rankfërmegen Zockertorus, Methylenblo direkt bindt. D'Associatiounskonstant fir den Aschlosskomplex läit bei ronn 310 pro molar, géintiwwer ongeféier 5846 pro molar fir d'Dimeriséierung vum Faarfstoff. Bei L929-Fibroblasten huet dës Bindung souwuel d'Zellfierwung wéi och d'Stimulatioun vun der Glukosopnam blockéiert: Eng Virinkubatioun mam Cyclodextrin huet déi blo Fierwung verhënnert, a wann en duerno bäigefüügt gouf, huet en d'Entfierwung beschleunegt. Wéi dat optescht bloe Signal aus den Zelle verschwonnen ass, ass den aktivéierte Glukostransport enk parallel dozou ofgeklongen.

D'Auteuren hunn dës Korrelatioun esou interpretéiert, datt si éischter fir eng direkt Interaktioun tëscht dem Faarfstoff an engem Protein am Aktivéierungswee vum Glukostransporter schwätzt wéi fir e laang unhalende Mechanismus vum oxidative Stress. Dës Schlussfolgerung ass plausibel, huet awer Grenzen. D'Experiment identifizéiert de Protein net, et weist keng Bindung un den Transporter selwer, an d'Korrelatioun tëscht der Entfierwung an dem Verloscht vum Effekt kann net all redoxvermittelte Wee ausschléissen.

Déi bleiwend Lektioun betrëfft d'Miessung. Eng optesch Fierwung weist siichtbaren, oxidéierten, mat der Zell associéierte Faarfstoff un. Si erfaasst de faarflosen, reduzéierte Bestand iwwerhaapt net. Eng blatzeg Zell kann also nach ëmmer Faarfstoffequivalenten enthalen, an eng intensiv gefierft Zell weist festgehalen oxidéierte Faarfstoff un, net déi ganz Expositioun vum Gewebe oder d'Gréisst vum Effekt. Déiselwecht Virsiicht gëllt och op méi groussem Moossstaf: Wann ee Fierwungen tëscht Zellzorte vergläicht oder en donkele Gewebeschnëtt als Beweis fir eng méi héich Expositioun behandelt, widderhëlt een den ursprénglechen Interpretatiounsfeeler bei der Kulturschuel. D'Opnam ass en Zyklus aus Reduktioun, Diffusioun a Reoxidatioun, an all eenzel Momentopnam vun der bloer Form weist nëmmen een Deel dovun. Déi praktesch Konsequenze fir d'Fierwen an d'Handhabung am Laboratoire an d'Interpretatioun vun Aussoen iwwer Dosis an Expositioun erginn sech direkt doraus.