Firwat d'Absorptioun vu Methylenblo sech mat der Konzentratioun ännert

Huelt eng Fläsch mat enger Stammléisung vu Methylenblo a fëllt zwee Glieser. Fëllt dat éischt mat der Stammléisung an dat zweet mat enger zéngfacher Verdënnung. Dat zweet Glas ass, wéi erwaart, méi blatzeg. Wann Dir genee hikuckt, gesitt Dir, datt sech nach eppes geännert huet. De Faarftoun huet sech verréckelt. Déi eng Léisung tendéiert zu engem kloren Himmelblo, déi aner zu engem Blo mat engem violetten Toun. D'Verdënnung huet méi gemaach, wéi nëmmen d'Intensitéit ze reduzéieren. Si huet geännert, wéi eng cheemesch Spezies de gréissten Deel vun der Absorptioun iwwerhëlt.

D'Konzept hannert dëser Verrécklung ass einfach. Opgeléiste Methylenblo besteet net nëmmen aus enger Spezies. Dat eenzelt Faarfstoffkation, Monomer genannt, ka sech mat engem zweete Kation Fläch u Fläch stapelen an en Dimer bilden, an Dimeren kënnen zu méi groussen Aggregater wuessen. All Form huet hiert eegent Absorptiounsspektrum. Wat e Spektrophotometer uweist, ass d'Zomm vun der Mëschung, déi an där Küvett ënner deene Bedéngunge virläit. Wann d'Mëschung sech ännert, verréckelt sech d'Spektrum, och wann de gesamte Faarfstoffgehalt engem einfache Verdënnungsverhältnis follegt.

Monomer an Dimer absorbéieren ënnerschiddlech

Stellt Iech de Monomer als eng flaach Kaart vir, mat enger positiver Ladung, déi iwwer säi Ringsystem verdeelt ass. Zwou esou Kaarte kënne Fläch u Fläch leien. Déi positiv Ladunge stoussen sech of, mee déi flaach aromatesch Fläche zéie sech duerch Stapelwiesselwierkungen un, an d'Waasser an d'Géigenionen ronderëm schiermen d'Ofstoussung of. D'Resultat ass e gebonnent Puer mat gemeinsamen elektroneschen Zoustänn. Seng erlaabt Iwwergäng leien op méi héijer Energie wéi den Iwwergang vum Monomer. Dofir erschéngt d'Dimerband bei enger méi kuerzer Wellelängt wéi d'Monomerband, wärend méi grouss Aggregater nach méi wäit op der bloer Säit als Schëller bäidroen.

Bei ganz niddreger Konzentratioun a propperem Waasser dominéieren d'Monomeren an domat d'Band bei laanger Wellelängt. Wann d'Gesamtkonzentratioun eropgeet, kritt déi gepaart Form e wuessenden Undeel, an d'Band bei méi kuerzer Wellelängt wiisst am Verglach mat der éischter. D'Verhältnis vun den zwou Bande weist also d'Zesummesetzung vun der Mëschung un, net direkt d'Gesamtkonzentratioun. Eng Miessung bei nëmmen enger Wellelängt kann déi zwou net auserneenhalen, ouni eng Viraussetzung doriwwer ze maachen, wéi eng Form virläit.

Dofir gehéieren d'Bedéngungen ëmmer bei d'Referenzspekteren. D'Spektralreferenz fir Methylenblo tabelléiert d'Bandpositiounen zesumme mam Léisungsmëttel, der Salzzesummesetzung, dem pH, der Temperatur an dem Konzentratiounsberäich, bei deenen se entstane sinn. Wann een e Maximum ouni dës Bedéngungen ugëtt, ass d'Zuel net genuch spezifizéiert. Zwee Laboratoirë kënne mat ënnerschiddleche Spektere vum selwechte Faarfstoff allebéid richteg leien, well si ënnerschiddlech Mëschunge gemooss hunn.

Wat d'Gläichgewiicht verréckelt

D'Konzentratioun ass den Haapthebel. Fir en Dimer ze bilden, mussen zwee Monomeren openeentreffen. Dofir klëmmt säin Undeel méi séier wéi linear mam gesamte Faarfstoffgehalt. Déi publizéiert Dimeriséierungskonstante fir wässerlech Léisunge leien no bei Raumtemperatur bei Dausende pro molar, sou datt den Dimerundeel am mikromolare Beräich staark klëmmt. Eng breet global Upassung iwwer e mikromolare bis millimolare Faarfstoffberäich huet schonn ënner 34 mikromolar en Tetramerbäitrag fonnt, deen net null war. Dat warnt virun enger strikt op zwou Spezies limitéierter Upassung bei Konzentratioune vun Zéngzuel vu Mikromolar. Déi genee Undeeler hänke vum Medium of. Dofir beschreift dësen Artikel Tendenzen amplaz vun enger universeller Ëmrechnungstabell.

Salz ass den zweeten Hebel. Opgeléisten Ione schiermen d'Ofstoussung tëscht zwee Kationen of. Dofir verréckelen zougesat Natriumchlorid an änlech Elektrolyten d'Mëschung bei där selwechter Faarfstoffkonzentratioun a Richtung Dimeren an Aggregater. Dësen Effekt ass a Studien iwwer d'Aggregatioun vu Methylenblo a salzhalegen a wässerleche Medien ze gesinn, an deene Faarfstoff vun ongeféier 1 mikromolar bis 3.4 millimolar bei 0 bis 0.15 molar Natriumchlorid gemooss gouf. Bei där Upassung huet den Tetramerundeel ongeféier 0.93 erreecht, wou souwuel de Faarfstoffgehalt wéi och de Salzgehalt héich waren. E Spektrum, dat am Waasser opgeholl gouf, an eent, dat an enger physiologescher Salzléisung opgeholl gouf, sinn dofir keng austauschbar Standarden.

D'Temperatur wierkt an déi aner Richtung. D'Stapelung setzt gebonnent Waasser fräi a gëtt duerch thermesch Beweegung behënnert. Dofir féiert d'Erwierme vun enger Léisung typescherweis dozou, datt en Deel vun den Dimeren nees a Monomeren zerfält, wärend Ofkillen d'Associatioun begënschtegt. Déi duerch Upassung bestëmmt Dissoziatiounsenthalpie ass negativ, ongeféier minus 30 Kilojoule pro Mol iwwer 282 bis 333 kelvin, wat eng exotherm Associatioun bestätegt. Eng kal Prouf, déi direkt nom Eraushuelen aus dem Frigo gemooss gëtt, ka méi staark aggregéiert wierke wéi déiselwecht Prouf, nodeems si sech op Raumtemperatur agestallt huet.

D'Léisungsmëttel bestëmmt d'Ausgangslag. Waasser mat sengem staarken hydrophoben Effekt begënschtegt d'Stapelung vu flaache Faarfstoffkationen. Alkohole wéi Ethanol a Methanol solvatéieren d'Réng besser a léisen d'Aggregater op. Dofir weist déiselwecht Faarfstoffkonzentratioun an Ethanol méi Monomere wéi am Waasser. Aprotesch Co-Léisungsmëttel maachen datselwecht: A Waasser-DMSO-Mëschunge bei 293 kelvin huet zougesaten DMSO d'Dimeriséierung ënnerdréckt, wat d'Waasserstruktur als dreiwend Kraaft vun der Stapelung ausweist. Bei Tenside muss een a béid Richtunge virsiichteg sinn. Iwwer hirer kritescher Mizellekonzentratioun kënne Mizellen eenzel Monomere solubiliséieren an e monomeränlecht Spektrum erëmhierstellen. Ënner deem Punkt kann en entgéintgesat geluedenen Tensid amplaz d'Stapelung förderen: Bei 100 mikromolar Faarfstoff huet déi duerch SDS ugedriwwe Polymeriséierung hire Maximum no bei 4 millimolar SDS erreecht, ongeféier der Hallschent vun der Mizellekonzentratioun, ier bei méi héijen Tensidgehalter eng Ëmverdeelung stattfonnt huet. Aarbechten iwwer d'Effekter vu Faarfstoff-Léisungsmëttel-Wiesselwierkungen an organiséierte Medien op Methylenblospekteren weisen, wéi staark déi direkt molekular Ëmgéigend, an net nëmmen d'Gesamtkonzentratioun, déi observéiert Bande bestëmmt.

De pH ass haaptsächlech an den extremen Beräicher wichteg. Am bal neutrale Beräich, deen an de meeschte Laboraarbechte benotzt gëtt, bleift Methylenblo a senger bekannter kationescher bloer Form, an d'Aggregatioun dominéiert d'Spektralverhalen. Staark Saieren oder Basen, Redoxcheemie, déi déi faarflos Leukoform produzéiert, oder d'Bindung u Proteinen a Partikelen addéieren all Zoustänn iwwer de Monomer-Dimer-Puer eraus. Wann e Spektrum sech nom Zousaz vun engem Puffer ännert, kontrolléiert d'Pufferzesummesetzung op Salz a bindend Bestanddeeler, éier Dir alles eleng dem pH zouschreift. D'Referenz iwwer Cheemie a Protonéierung hält dës Identitéitsfroe getrennt vun der Aggregatiounsfro, déi hei behandelt gëtt.

Firwat d'Beer-Lambert-Gerued sech béit

D'Beer-Lambert-Relatioun seet, datt d'Absorbanz gläich der Absorptivitéit mol der Konzentratioun mol der Weeërängt ass. Et ass e Gesetz, dat op Zielen opbaut. Et setzt viraus, datt déi gezielten Objete gläich bleiwen, wann hir Zuel sech ännert: eng absorbéierend Spezies, e feste Spektrum, keng konzentratiounsofhängeg Cheemie, monochromatescht Miessliicht, keng Streeung oder Reemissioun, a Liicht, dat tatsächlech de spezifizéierte Wee duerchleeft.

Aggregatioun brécht déi éischt Viraussetzung. Formal bleift d'Gesamtabsorbanz eng Zomm iwwer d'Spezies: d'Weeërängt mol déi jeeweileg Absorptivitéit mol déi jeeweileg Spezieskonzentratioun. All Spezies follegt dem Gesetz. D'Mëschung net, well d'Spezieskonzentratioune netlinear Funktioune vum gesamte Faarfstoffgehalt sinn. Eng Kalibratiounskurv vun der Absorbanz bei der Monomerband géint de gesamte Faarfstoffgehalt fänkt dofir bei staarker Verdënnung riicht un a béit sech no ënnen, wann d'Konzentratioun klëmmt, well all weideren Zouwuess proportionell manner Monomer bäibréngt. Eng Kurv, déi bei der Dimerband gemooss gëtt, béit sech an déi aner Richtung. Aggregatiounsaarbechte nennen genee dëse Mechanismus als Quell vun den observéierte Lambert-Beer-Ofwäichungen. Eng Gerued duerch de gebéite Beräich unzepassen an ze extrapoléieren ass den typesche Feeler. D'Gerued ass nëmme bannent deem Beräich an där Matrix valabel, an deenen si erstallt gouf.

D'Verdënnung schaaft eng änlech Fal. Wann een eng konzentréiert Stammléisung verdënnt, fir an de Miessberäich vum Instrument ze kommen, bleift d'Speziesverhältnis net erhalen. An der verdënnter Küvett stellt sech d'Gläichgewiicht a Richtung Monomer nei an. Hiert Spektrum beschreift also déi verdënnte Prouf richteg, mee d'Stammléisung falsch. Wann een d'Spektrum vun der Stammléisung zréckrechent, andeems een d'Absorbanzwäerter eropskaléiert, kritt een nëmmen dann eng richteg Schätzung vum Gesamtgehalt, wann d'Kalibratioun dës Verrécklung schonn berücksichtegt. Déi ursprénglech Bandform gëtt domat ni erëmhiergestallt. Wien d'Spektrum vun engem Konzentrat mat enger verdënnter Referenz vergläicht, vergläicht zwou ënnerschiddlech Mëschungen.

D'Weeërängt ass en Deel vum Resultat

D'Absorbanz skaléiert mat der Distanz, déi d'Liicht duerch d'Prouf zréckleet. Eng 10 mm Küvett liwwert zéngmol d'Absorbanz vun enger 1 mm Küvett mat där selwechter Léisung. Dës Skaléierung ass nëmme fir déiselwecht Léisung exakt, an duerch d'Aggregatioun gëtt dës Aschränkung entscheedend.

An der Praxis ass d'Weeërängt e Mëttel, fir am valabele Beräich ze bleiwen. E laange Wee bitt Empfindlechkeet fir verdënnten, haaptsächlech monomeresch Léisungen. E kuerze Wee hält eng konzentréiert Prouf am Miessberäich, ouni e grousse Verdënnungsschrëtt, deen d'Gläichgewiicht nei astelle géif. D'Aggregatiounsfuerschung hannert den uewe genannte Wäerter huet genee esou geschafft: 1 Zentimeter Küvette fir 1.1 bis 34 mikromolar Faarfstoff an 0.01 Zentimeter Küvette fir 94 mikromolar bis 3.4 millimolar. Mikrovolumen-Miesssockelen a Mikrotiterplackelieser hunn hir eege Geometrie, mat kuerzen an heiansdo variabele Weeër an Uewerflächen, un déi de kationesche Faarfstoff adsorbéiere kann. Gitt d'Weeërängt zesumme mam Wäert un, genee wéi d'Spektralreferenz d'Léisungsmëttel an d'Salz ugëtt. Eng Absorbanz ouni Weeërängt ass kee Resultat. Si ass e Gerücht.

D'Miessdisziplin ergëtt sech aus dem Mechanismus. Loosst d'Prouwe virun der Miessung déiselwecht Temperatur erreechen. Benotzt dee selwechte Küvettentyp an déiselwecht Orientéierung, ofgestëmmt Blindprouwe mat där selwechter Salz- a Pufferzesummesetzung, a proppert Glasgeschier. Methylenblo adsorbéiert nämlech u Glas a Plastik, an eng verfierft Küvett behält eng Erënnerung un déi lescht konzentréiert Prouf. Moosst séier no der Preparatioun, wann d'Aggregatiounskinetik eng Roll spillt, an erstellt all Kalibratiounskurv an där selwechter Matrix a mat där selwechter Weeërängt wéi déi onbekannt Prouwen. Bei visuellen Iwwerpréiwunge sollt Dir drun denken, datt d'A e schlechte Spektrometer ass. Ob een mat der Faarf vun enger Léisung hir Rengheet feststelle kann, ass eng separat Fro, déi mat Nee ze beäntweren ass, an d'Faarftounverrécklunge wéinst Aggregatioun sinn ee Grond dofir.

En Diagramm fir nieft dem Instrument

D'Figur hei drënner faasst den Artikel zu enger Referenz fir de Labordësch zesummen. Dräi Léisungen enthalen dee selwechte Faarfstoff, ënnerscheede sech awer an der Gesamtkonzentratioun an der Salzzesummesetzung. Hir schematesch Spektere weisen, wéi d'Monomerband bei laanger Wellelängt mat zouhuelender Stapelung Undeel un d'Dimerband bei méi kuerzer Wellelängt verléiert. D'Bedéngunge stinn op der Figur, well d'Kurven ouni si net weiderbenotzt kënne ginn. Fir gemoosse Bandpositiounen ënner spezifizéierte Bedéngungen, benotzt d'Spektralreferenz. Fir ze verstoen, wéi de Faarfstoff an d'Zelle kënnt, wann en opgeléist ass, kuckt Zellopnam duerch Reduktioun a Verdeelung. Fir ze verstoen, wéi d'Liichtdosis an d'Geometrie fotocheemesch Miessresultater weider beaflossen, kuckt Liichtexpositioun a Miessgeometrie.

D'Reegel, déi ee sech mierke soll, huet zwou Hallschenten. D'Spektrum identifizéiert d'Mëschung, déi ënner de spezifizéierte Bedéngungen an der Küvett virläit. Nëmmen eng Kalibratioun, déi ënner deene selwechte Bedéngungen erstallt gouf, rechent eng Absorbanz an eng Gesamtkonzentratioun ëm.