Метилен көгү клеткаларга кантип кирет: калыбына келүү, кайра кычкылдануу, сиңүү

Идиштеги эндотелий клеткаларынын метилен көгүн сиңирип жатканын байкасаңыз, эң айкын көрүнгөн түшүндүрмө ошол эле учурда жаңылыш да болот. Чөйрө көк түсүн жоготот, клеткаларда көк гранулалар пайда болот, демек, боёк мембранадан көк молекула түрүндө өткөндөй сезилет. Эксперименттер башкача жыйынтыкты көрсөтөт. Көк форма мембранадан дээрлик өтпөйт. Өткөнү — түссүз форма, ал эми клетканын ичинде көрүнгөн көк түс зат киргенден кийин ошол жерде пайда болот.

Бул тескери көрүнүш маанилүү, анткени ал боёлуу эмнени көрсөтө аларын жана эмнени көрсөтө албасын аныктайт. Көк гранулалар органеллаларда кайра кычкылданып, кармалып калган кычкылданган боёкту көрсөтөт. Алар клеткадагы боёктун жалпы көлөмүн да, калыбына келген форманын запасын да көрсөтпөйт жана биологиялык таасирди өлчөбөйт. Мунун себебин түшүнүү үчүн үч кадамды карап чыгалы: бетинде калыбына келүү, калыбына келген форманын диффузиясы, ичинде кайра кычкылдануу жана кармалып калуу.

Эки форма өзүн ар башка молекулалардай алып жүрөт

Кычкылданган метилен көгү — жалпак, оң заряддуу шакекче системасы. Ал сууда эрийт, болжол менен 600–700 нанометр аралыгындагы жарыкты күчтүү сиңирет жана көк болуп көрүнөт. Негизги нерсе — заряд. Заряддуу, сууга жакын молекула липиддик мембранадан оңой өтпөйт. Ошондуктан адабияттарда кылдаттык менен «мембранадан салыштырмалуу начар өтөт» деп айтылат, «такыр өтпөйт» деп эмес.

Лейкометилен көгү деп аталган калыбына келген метилен көгү түссүз, зарядсыз жана майда эрүүчү болот. Зарядды алып салганда мембрана дубал болбой калат. Калыбына келген молекула ал аркылуу оңой диффузияланат. Ичиндеги кычкылдандыруучу касиети күчтүүрөөк бөлүккө кирген соң, ал кайра электрондорун жоготуп, көк, заряддуу жана кармалып калган формасына кайта алат. Ошентип, боёктун кычкылдануу-калыбына келүү химиясы ошол эле учурда анын ташылуу механизми да болуп саналат. Электрондордун санын өзгөртсөңүз, мембранадан өтүү жөндөмүн да өзгөртөсүз.

Биринчи кадам үчүн электрондор клетканын өзүнөн келет. Сүт эмүүчүлөрдүн клеткалары плазмалык мембрана аркылуу электрондорду ташып, калыбына келтирүүчү эквиваленттерди клетка ичиндеги донорлордон сырттагы, бетинде жайгашкан акцепторлорго өткөрөт. Плазмалык мембрана аркылуу жүргөн бул иш-аракет клетканын кадимки функциясы болуп, клеткалардын көпчүлүк түрлөрүндө кездешет. Тиазин боёктору менен иштеген эндотелийдин беттик редуктазасы бир маанилүү жагынан башка ушундай системаларга окшош: кийинки кадамдарды токтоткон өлчөмдөгү цианид жана азид бар болсо да, ал иштей берет. Бул ажырым бүтүндөй түшүндүрмөнүн өзөгүн түзөт.

Адегенде фазалар аралык бөлүштүрүлүү изилденген жана ал сиңүүнү дээрлик түшүндүргөн

1929-жылы Рокфеллер институтунда Мариан Ирвин жөнөкөйүрөөк суроо койгон. Балким, боёктун кириши жөн гана суу менен клетканын майлуу катмарларынын ортосунда бөлүштүрүлүүдөн көз карандыдыр, ал эми лабораторияда ошол майлуу катмарлардын ордуна хлороформ катмарын колдонууга болоттур. Анын өтүүнү спектрофотометриялык изилдөөлөрүндө боёктун суудагы эритмелери хлороформ менен чайкалып, органикалык фазага өткөн заттар тирүү балыр клеткаларына кирген заттар менен салыштырылган.

Ал иштен алынган эки жыйынтык дагы эле көңүл бурууга арзыйт. Биринчиден, коммерциялык метилен көгүнүн эритмелеринде азыр azure B деп аталган триметилтионин болгон. Бул кошулма метилен көгүнүн өзүнө караганда тезирээк кирген, айрыкча майда эрүүчү эркин негиз формасы басымдуулук кылган щелочтуу pH шартында. Метилен көгүнүн кириши сыяктуу көрүнгөн айрым учурлар чындыгында azure Bнин тандалма кириши болгон. Экинчиден, pH иондошуу абалын аныктоо аркылуу натыйжага таасир эткен, ал эми жабыркаган клеткалар бүтүн клеткаларга караганда алда канча көп боёк өткөргөн. Бөлүштүрүлүү коэффициенттери жана заряддын абалы жасалма система менен тирүү клетканын ар бири эмнени сиңирерин аныктаган. Экөөнүн окшоштугу клетканын чек арасында суусуз катмарлар бар деген түшүнүктү колдогон.

Бул модель липиддердин жана иондошуунун маанисин алдын ала туура түшүндүргөн. Бирок ал өзүнүн баштапкы формасында бөлүштүрүлгөн боёк менен бетинде химиялык жактан өзгөрүп, башка формада өтүп, ичинде кайра баштапкы формасына келген боёкту айырмалай алган эмес. Бул айырманы аныктоо үчүн башка эксперимент керек болгон. Ал жетимиш жылдан кийин өпкө эндотелийинде жүргүзүлгөн.

Сыртында калыбына келүү, ичинде кармалып калуу

Меркер жана кесиптештери өстүрүлгөн уйдун өпкө артериясынын эндотелий клеткалары менен иштеп, үч кадамдуу ырааттуулукту сунушташкан: кычкылданган боёк клетканын бетинде түссүз липофилдүү формасына чейин калыбына келет, калыбына келген форма ичкери диффузияланат, андан соң клетка ичинде кайра кычкылдануу мембранадан өтпөгөн кычкылданган форманы калыбына келтирип, ал топтолот. Алардын эндотелийдин тиазинди сиңиришин изилдөөсү бул ырааттуулукту анын белгилүү жерлерин үзгүлтүккө учуратуу аркылуу текшерген.

Биринчи каражат клеткага кире албаган электрон акцептору — феррицианид болгон. Беттик ферменттер клетканын сыртында көк боёкту түссүз формасына чейин калыбына келтиргенде, феррицианид ошол электрондорду кайра тартып алып, боёк мембранадан өтө электе чөйрөдө көк форманы кайра пайда кыла алат. Феррицианид ашыкча өлчөмдө турганда, башкача айтканда 10 микромоляр боёкко 50–500 микромоляр феррицианид туура келгенде, боёктун сиңиши дээрлик токтогон. Феррицианид сарпталып бүткөндөн кийин гана сиңүү кадимки ылдамдыгына кайтып келген. Кинетика да муну башка жол менен көрсөткөн. Феррицианид болжол менен туруктуу ылдамдыкта азайган. Бул кайра-кайра колдонулуучу ортомчуга электрон берип турган туруктуу беттик калыбына келүү агымына туура келген. Ал эми клетка сыртындагы боёктун запасы азайган сайын анын көлөмү экспоненциалдуу түрдө төмөндөгөн. Туруктуу агым менен азайып жаткан запас бирге феррицианиддин сигналы эритмеден чыгып жаткан боёк молекулаларын эмес, үзгүлтүксүз калыбына келүүнү көрсөтөрүн билдирет.

Экинчи каражат мембранадан өтүү кадамын толугу менен алып салган. Изилдөөчүлөр тиазиндердин жакын тектеши болгон толуидин көгү Oну чоң полиакриламид чынжырына бириктиришкен. Ал чынжыр эки кычкылдануу абалынын биринде да клеткага кире албай тургандай чоң болгон. Ошентсе да клеткалар чынжырга бекитилген боёкту калыбына келтирген. Демек, калыбына келүү үчүн клетканын ичине кирүү зарыл эмес. Тиешелүү механизм бетинде жайгашкан же аны менен электрдик жактан байланышкан.

Андан кийин макаланын аталышына негиз болгон ажырым аныкталган. 2 миллимоляр концентрациядагы цианид жана азид боёктун топтолушун катуу басаңдаткан. Микроскопто адатта ядрону курчап турган кочкул көк жана кызгылт көк кошулмалар дээрлик жоголгон. Бирок эки ингибитордун бири да клетка сыртындагы калыбына келүүнү жайлаткан эмес: феррицианиддин айлануусу басаңдабай уланган жана мембранадан өтпөгөн полимер дагы эле калыбына келген. Тоскоолдук кийинки баскычта болгон. Цианид менен азид беттик калыбына келүүнү эмес, клетка ичиндеги кайра кычкылданууну жана бөлүнүп кармалып калууну токтоткон. Клеткалардын жашоого жөндөмдүүлүгүн текшерүү бул чечмелөөнү колдогон: ушул таасирлер учурунда клеткалар цитозолдук маркер ферменти болгон лактатдегидрогеназаны сактап калган. Демек, сиңүүнүн жоголушу жөн гана уулануунун же мембрананын жарылышынын натыйжасы болгон эмес.

Макаладагы бир эскертүү азыр да күчүндө. Көк кошулмалар ядронун айланасында болгон, бирок анын ичинде болгон эмес. Бул клетка ичиндеги органеллаларда кычкылдануу жүрөрүнө туура келет, бирок изилдөө кайсы органеллалар экенин аныктаган эмес. Башка клетка түрлөрүндөгү ушуга окшош көрүнүштөр жетишсиз далилдердин негизинде лизосомалык деп аталган. Кармалып калууну аныкталган факт, ал эми анын так ордун азырынча болжол катары кабыл алуу керек. Электрондор андан ары кайда барарын байкаган окурмандар митохондриялык электрон ташуу жана кычкылдануу-калыбына келүү процесстерин жөнгө салуу жөнүндө, ошондой эле киргизүү жолуна жараша сиңүү жана бөлүштүрүлүүнүн жалпы көрүнүшү тууралуу окуй алышат.

Боёлуу затка кабылыштын өлчөмү эмес

Үчүнчү изилдөө сиңүүнүн бул механизми биологиялык көрсөткүч менен салыштырылганда эмне болорун көрсөтөт. Скотт жана кесиптештери шакек түрүндөгү тор сымал кант молекуласы — метил-бета-циклодекстрин — метилен көгүн түздөн-түз байланыштырарын аныкташкан. Киргизүү комплекси үчүн ассоциация константасы болжол менен 310 молярга тескери бирдикти түзгөн, ал эми боёктун димерлешүүсү үчүн бул көрсөткүч болжол менен 5846 молярга тескери бирдик болгон. L929 фибробласттарында бул байланыш клеткалардын боёлушун да, глюкозаны сиңирүүнүн күчөшүн да бөгөттөгөн: циклодекстрин менен алдын ала инкубация көк түскө боёлушту алдын алган, ал эми аны кийин кошуу түстүн кетишин тездеткен. Оптикалык көк сигнал клеткалардан жоголгон сайын активдешкен глюкоза ташуу да аны менен тыгыз катарлаш басаңдаган.

Авторлор бул корреляцияны узакка созулган кычкылдануу стресси механизмине караганда, боёк менен глюкоза ташуучуну активдештирүү жолундагы бир белоктун түздөн-түз өз ара аракеттенүүсүн колдогон белги катары чечмелешкен. Бул тыянак негиздүү, бирок чектери бар. Эксперимент белоктун атын аныктабайт, ташуучунун өзү менен байланышууну көрсөтпөйт жана түстүн кетиши менен таасирдин жоголушунун ортосундагы корреляция кычкылдануу-калыбына келүү аркылуу жүргөн бардык жолдорду четке кага албайт.

Негизги сабак өлчөөгө байланыштуу. Оптикалык боёлуу көзгө көрүнгөн, кычкылданган жана клетка менен байланышкан боёкту көрсөтөт. Ал түссүз калыбына келген форманын запасын таптакыр көрбөйт. Ошондуктан өңү ачык клеткада дагы эле боёктун эквиваленттери болушу мүмкүн, ал эми күчтүү боёлгон клетка ткандын затка жалпы кабылышын же таасирдин көлөмүн эмес, кармалып калган кычкылданган боёкту көрсөтөт. Ушул эле эскертүү чоңураак масштабда да колдонулат: ар башка клетка түрлөрүнүн боёлушун салыштыруу же ткандын кочкул кесиндисин затка көбүрөөк кабылганынын далили катары кабыл алуу идиштеги алгачкы жаңылыштыкты кайталайт. Сиңүү — калыбына келүүнүн, диффузиянын жана кайра кычкылдануунун цикли. Көк форманын бир гана учурдук көрүнүшү анын бир бөлүгүн гана ачат. Мунун лабораториялык боёо жана иштетүү үчүн, ошондой эле доза жана затка кабылыш тууралуу билдирүүлөрдү чечмелөө үчүн практикалык мааниси түздөн-түз ушундан келип чыгат.