메틸렌 블루는 미토콘드리아 복합체 III를 우회할 수 있을까? 연구 결과가 엇갈리는 이유

두 연구실이 메틸렌 블루가 차단된 미토콘드리아 복합체 III를 우회할 수 있는지 물었다. 한쪽의 답은 아니었고, 다른 쪽의 답은 그렇다는 것이었다. 양쪽 모두 데이터가 있었다.

생쥐 뇌 미토콘드리아를 사용한 첫 번째 연구에서는 이 염료가 우회할 수 없다고 판단했다. 세 설치류 종의 뇌 미토콘드리아를 사용한 두 번째 연구에서는 부분적으로 우회할 수 있다고 판단했다. 생쥐 간을 사용한 세 번째 연구도 이와 함께 자주 인용되지만, 실제로는 다른 대상을 시험했다. 이 연구를 올바른 맥락에 놓으면 혼란의 절반은 해소된다.

여기서 보편적인 기전을 선언할 수는 없다. 차단제, 투여량, 측정 지표가 서로 다른 세 실험이 있을 뿐이다. 먼저 조건을 살펴보자. 결론은 그다음이다.

여기서 우회란 무엇인가

전자는 복합체 I을 통해 NADH에서, 또는 복합체 II를 통해 숙신산에서 전자전달계로 들어온다. 이어 복합체 III를 거쳐 사이토크롬 c로 전달되고, 복합체 IV를 거쳐 산소로 전달된다. 이 과정에서 형성되는 기울기가 세포의 ATP 생성에 쓰인다.

우회한다는 주장은 메틸렌 블루가 차단 지점의 상류에서 전자를 받아 하류에 전달한다는 뜻이다. 산화형 염료는 NADH나 전자전달계 초기 구성 요소에서 전자를 받아 류코메틸렌 블루가 되고, 이 환원형은 전자를 사이토크롬 c에 넘기거나 전자전달계로 되돌려 보낸다. 전자가 차단 지점의 하류로 전달되면 호흡과 막전위가 부분적으로 회복된다. 차단 지점 자체나 그 상류로 전달되면 어느 것도 회복되지 않는다.

복합체 III의 한 가지 세부 사항이 이 논쟁의 상당 부분을 좌우한다. 이 복합체는 억제제가 작용하는 두 부위를 포함한 Q 회로를 수행한다. 안티마이신은 Qi 부위에 결합한다. 믹소티아졸은 Qo 부위에 결합한다. 둘 중 하나만 사용한 연구는 복합체의 절반만 시험한 셈이다.

첫 번째 연구: 생쥐 뇌 미토콘드리아에서는 우회하지 못함

Gureev와 동료들은 C57BL/6 생쥐의 대뇌피질 미토콘드리아를 디지토닌으로 분리하고, ml당 단백질 0.1 mg의 농도로 분석했다. 기질 조건은 세 가지였다. 피루브산과 말산을 각각 5 mM, 숙신산 10 mM와 글루탐산 2 mM, L-프롤린 10 mM를 사용했다. 차단제로는 로테논 1 micromolar(복합체 I)와 안티마이신 1 microgram per ml(복합체 III)를 사용했다. 염료 농도는 0.5, 1, 2 micromolar였으며, 주요 농도는 1 micromolar였다. 방법과 측정 곡선은 FEBS Letters 단보에 제시돼 있다.

복합체 I 우회는 작동했다. 로테논은 ADP로 자극한 호흡을 약 121에서 약 2 nmol per minute per mg로 낮췄고, 염료 1 micromolar는 이를 약 21까지 회복시켰다. 피루브산과 말산을 사용했을 때와 L-프롤린을 사용했을 때 막전위가 회복됐다.

복합체 III 우회는 작동하지 않았다. 안티마이신은 호흡을 약 16까지 낮췄고, 염료를 넣어도 약 20까지 올라가는 데 그쳤다. 염료 농도를 최대 5 micromolar까지 높여도 어떤 기질 조건에서도 막전위는 회복되지 않았다. 과산화물 데이터도 같은 방향을 가리켰다. 염료만 넣었을 때 과산화물 방출은 약 76 pmol per minute per mg의 기저 속도에서 세 농도에 따라 각각 약 1170, 1460, 1945로 증가했다. 그러나 안티마이신은 이 염료 유발 신호를 각각 약 25, 88, 96 percent 줄였다. 환원형 염료가 산소와 직접 반응한다면 복합체 III를 차단해도 신호가 억제돼서는 안 된다. 저자들은 환원형 염료가 안티마이신 차단 지점의 상류인 복합체 III의 Qo 부위에서 산화된다고 추론했다. 이 짧은 회로를 말로 풀면 전자 공여체에서 염료로, 염료에서 Qo로, 그다음은 정상 경로를 따라 전달되는 것이다. 로테논에 의한 차단은 우회하지만, 안티마이신에 의한 차단은 우회하지 못한다.

두 번째 연구: 세 종에서 두 억제 부위 모두 부분적으로 우회

Svab와 동료들은 실험 설계를 확장했다. 생쥐, 쥐, 기니피그의 뇌 미토콘드리아를 Percoll로 분리하고, 동일하게 0.1 mg per ml의 농도로 분석했다. 기질은 피루브산과 말산 또는 글루탐산과 말산을 각각 5 mM로 사용했다. 복합체 III 차단제는 두 가지였다. 안티마이신 A 0.3 micromolar와 믹소티아졸 1 micromolar를 사용했다. 염료는 대부분의 분석에서 2 micromolar, 사이토크롬 c 실험에서는 0.5 micromolar였다. 세 종 모두에 동일한 프로토콜을 적용한 결과가 오픈 액세스 논문에 제시돼 있다.

세 종 모두에서 두 차단이 부분적으로 우회됐다. 생쥐 미토콘드리아에서 안티마이신이 호흡을 억제했고, 염료는 이를 약 37에서 59 nmol per minute per mg로, 약 60 percent 높였다. 믹소티아졸은 호흡을 88 percent 억제해 약 4.5까지 낮췄고, 염료는 이를 약 23으로 다섯 배 높였다. 어느 억제제를 사용하든 막전위가 부분적으로 재분극됐다. 광학적 아티팩트를 배제하기 위해 두 염료인 사프라닌 O와 비율 측정형 TMRM으로 이를 측정했다.

이 논문은 첫 번째 연구에서 하지 않았던 전자 전달의 직접 검증도 수행했다. 외부에서 첨가한 아세틸화 사이토크롬 c 25 micromolar는 억제제 유무와 관계없이 에너지가 공급된 미토콘드리아에 의해 환원되지 않았지만, 염료를 추가하면 두 경우 모두 환원이 일어났다. 세포가 없는 완충액에서는 NADH와 염료가 사이토크롬 c를 환원했으며, 그 속도는 NADH에 비례했다. 이 더 긴 도약을 말로 풀면 환원 당량에서 염료로, 염료에서 사이토크롬 c로 직접 전달된 뒤 복합체 IV를 거쳐 산소로 전달되는 것이다. 이 경로는 복합체 III를 완전히 건너뛰므로 두 차단제 모두 우회할 수 있다.

두 가지 추가 측정 결과도 이 해석을 뒷받침한다. 믹소티아졸로 처리한 미토콘드리아에 염료를 넣자 NAD(P)H 형광이 감소했다. 이는 환원 당량이 새 경로를 통해 소모됐음을 뜻한다. 또한 660 nm에서의 염료 흡광도는 물질을 차례로 첨가할 때마다 변화를 보였다. 원심분리한 상등액 분석에서는 산화형 염료가 에너지가 공급된 미토콘드리아 내부에 100배 넘게 농축됐다가 막전위가 무너지면 빠져나오는 것으로 나타났다. 양성자 수지로도 설명된다. 양성자 펌핑 단계를 건너뛰면 전자쌍당 양성자가 10개가 아니라 약 2개만 이동한다. 따라서 산소 사용이 빨라지면서 재분극은 부분적으로만 일어나는 양상은 실제 우회의 모습이지, 우회에 반하는 증거가 아니다.

동일한 미토콘드리아 시료에서 나타난 반응은 피상적으로 읽으면 잘못 해석하기 쉬웠다. 억제제와 염료가 함께 있을 때 ADP는 호흡을 높이는 대신 낮췄고, 수송 차단은 호흡을 늦추는 대신 자극했다. 그런데도 막전위는 여전히 정상적인 방향으로 변했다. 이 시스템에서는 산소 소비량만 보면 오판하게 된다.

세 번째 연구: 복합체 III가 아니라 I과 II를 시험한 간 연구

Lee와 Boelsterli는 생쥐 간 미토콘드리아와 배양 간세포를 사용했다. 이들은 에파비렌즈(복합체 I, IC50 약 30 micromolar)와 이소니아지드의 대사산물인 하이드라진(복합체 II, IC50 약 30 micromolar)으로 손상시켰다. 약 30 micromolar의 염료는 NADH 산화, 막전위, ATP를 회복시키면서 산화성 물질과 괴사성 세포 사멸을 줄였다. Redox Biology 논문은 이를 염료가 손상된 복합체 I과 II를 우회해 전자를 운반하는 모델로 설명한다.

이 결과는 상류 단계에 관한 확립된 배경 정보다. 이 연구에서는 복합체 III를 차단하지 않았으므로 복합체 III에 대해서는 아무것도 말해 주지 않는다. 어느 뇌 연구도 확인하거나 반박할 수 없다.

조건 비교표

두 복합체 III 연구가 각자의 실험 조건에서는 모두 맞을 수 있는 네 가지 이유

1. 차단제 처치가 같지 않았다. 한쪽은 안티마이신 단독 1 microgram per ml였고, 다른 쪽은 안티마이신 0.3 micromolar와 별도의 Qo 부위 차단제를 사용했다. Qo 부위로 전자를 전달하는 염료 경로가 막히는 바로 그 지점에서도, 사이토크롬 c로 직접 전달하는 경로는 작동할 수 있다. 한 부위의 결과로 두 부위를 모두 대변할 수는 없다.

2. 염료 농도와 측정 시점이 달랐다. 주요 농도는 각각 1과 2 micromolar였다. 이 산화환원 순환 물질의 흡수와 사이토크롬 c의 직접 환원은 농도와 시간에 의존한다. 작은 농도 차이와 측정 시점의 차이가 합쳐지면 같은 네트워크의 서로 다른 경로가 드러날 수 있다.

3. 시료 준비 방식이 달랐다. 디지토닌 분리와 Percoll 밀도 구배 분리는 서로 겹치지만 동일하지는 않은 미토콘드리아 집단을 선별한다. 단백질 농도는 0.1 mg per ml로 같았으므로 이 변수는 제외할 수 있지만, 하위 집단과 구조적 온전성의 차이는 남는다. 종 차이가 원인이라는 의심도 해소됐다. 두 번째 연구팀은 생쥐에서도 같은 반응 양상을 재현했다.

4. 기질 조건이 염료가 할 수 있는 일을 결정한다. 세 가지 기질 조건과 NADH 연계 기질 쌍을 사용한 조건은 서로 다르다. NADH 공급과 막전위는 함께 염료가 얼마나 빠르게 환원되는지, 어디에 분포하는지를 결정한다. 산화형 사이토크롬 c 가까이에 환원형 염료가 있어야 하는 경로는 이 선택에 좌우된다.

다음 우회 주장을 읽는 방법

어느 복합체를 어떤 억제제로, 어느 부위에서 어떤 농도로 차단했는지 확인하자. 염료 농도와 측정 시점도 확인하자. 조직, 종, 분리 방법, 단백질 농도, 기질도 확인하자. 그리고 막전위, 호흡, 산화환원 상태, 직접 전자 전달 분석 결과가 서로 일치하는지 확인하자. 여기서는 산소 소비량만으로 판단하면 잘못된 방향을 가리킨 경우가 한 번이 아니었기 때문이다.

제한된 범위의 요약은 유효하다. 염료의 복합체 I 우회에는 이견이 없다. 복합체 III의 경우, 안티마이신 1 microgram per ml와 염료 1 micromolar를 사용한 생쥐 미토콘드리아에서는 기능적 우회가 나타나지 않는다. 반면 안티마이신 0.3 micromolar 또는 믹소티아졸 1 micromolar와 염료 2 micromolar를 사용한 세 종에서는 염료에서 사이토크롬 c로의 직접 전자 전달과 함께 부분적 우회가 나타난다. 이 두 진술은 양립한다. 이보다 넓은 주장은 외삽이다.

관련 글은 논쟁 중인 주장을 이견이 없는 화학적 맥락 안에 놓아 준다. 전자 중계 과정은 메틸렌 블루가 전자를 이동시키는 방식, 확립된 상류 단계의 사례는 복합체 I 우회 실험, 두 염료가 필요했던 이유는 막전위 측정 지표와 그 아티팩트를 참고하자. 농도와 측정 시점의 함정은 산화환원 순환 물질의 실험실 취급을 다룬 내용을 참고하자.