顕微鏡観察におけるメチレンブルーの代替法

単純な細菌塗抹標本では、細胞の形態を観察することが目的であれば、メチレンブルーの代わりにクリスタルバイオレットを使用できます。生細胞の場合は、染色をまったく行わない位相差観察のほうが適した代替法となることがあります。選択は、何を観察する必要があるかによって決まります。

同じ細菌培養物を2人が観察しているとします。1人は桿状細胞と球状細胞を区別したいと考えています。もう1人は、処理によって細菌が死滅したかどうかを知りたいと考えています。前者に鮮明な像を与える染色法でも、後者には有用な答えを与えない場合があります。

代替法を選ぶ前に、次の文を完成させてください。「私は ___ 中の ___ を観察する必要があり、細胞は生存したままでなければならない／その必要はない。」 この文によって、染色法が果たすべき役割が決まります。

まず試料と観察目的を確認する

最初に細胞を生存させたままにする必要があるかを判断し、その後、観察したい特徴を特定します。

細胞を生存させたままにする必要がある場合：運動や形態の観察には、無染色の位相差またはDICを検討します。核DNAには、蛍光観察によるHoechst 33342を検討します。膜の完全性には、SYTO 9とヨウ化プロピジウムを用いる方法など、妥当性が確認されたアッセイを選びます。
細胞を生存させる必要がない場合：細菌形態には、クリスタルバイオレットによる単純染色またはニグロシンによる陰性染色を検討します。グラム反応には、完全なグラム染色法を使用します。固定細胞の核DNAには、DAPI蛍光染色を検討します。

以下の表で、各選択肢の制約を比較してください。ここで示しているのは方法の選択肢であり、既存のプロトコル内で試薬ボトルを単純に置き換えるための指示ではありません。

観察したいもの	試料と装置	代替候補	主な制約
細菌の形態と配列	調製済み細菌塗抹標本；明視野	クリスタルバイオレット単純染色	形態は確認できるが、グラム反応や生存性は判定できない。
暗い背景に対する細胞輪郭	細菌学的調製標本；明視野	ニグロシン陰性染色	調製方法と処方が重要であり、染色されていない細胞が必ずしも生きているとは限らない。
グラム反応	調製済み細菌塗抹標本；明視野	完全なグラム染色法	一連の試薬操作と対照が必要。
生細胞の運動または変化	適合する湿潤標本；位相差またはDIC	無染色	適切な光学系が必要であり、コントラストだけでは分子を同定できない。
核DNA	固定細胞；蛍光	DAPI	適合する励起フィルターと蛍光フィルターが必要。
生細胞の核DNA	生細胞；蛍光	Hoechst 33342	細胞内に取り込まれることだけでは、イメージング条件が無害であるとは判断できない。
細菌膜の完全性	未固定細菌；蛍光	SYTO 9とヨウ化プロピジウム	膜染色は生存性の間接的な指標。

単純塗抹標本では、方法を慎重に置き換える

細菌形態を単色で観察することが目的であれば、クリスタルバイオレットは実用的な候補です。FDAのBacteriological Analytical Manualには、単純染色に適した2種類のクリスタルバイオレット処方が掲載されています。文書化された処方と、その調製方法を使用してください。色素名だけでは、実際に使用できる試薬の組成は特定できません。

クリスタルバイオレットはグラム染色にも使用されますが、クリスタルバイオレットによる単純染色がグラム染色になるわけではありません。ASMのグラム染色プロトコルでは、鑑別結果は、クリスタルバイオレット、ヨウ素、脱色、対比染色が順番に作用することで得られます。これらの工程を省略すると、画像から判断できる内容が変わります。この違いについては、単純染色とグラム染色の比較を参照してください。

ニグロシンでは、別の方法で輪郭を可視化できます。背景を暗くし、細菌細胞を相対的に明るく見せます。Merckのニグロシン使用説明書には、一般的な代替法一覧では見落とされやすい重要な点があります。指定された使用処方にはホルムアルデヒドが含まれています。そのため、細胞自体が染色されていないように見えても、「陰性染色」という名称だけから生細胞への適合性を判断することはできません。完全な処方と試料調製法を確認してください。

生きた試料では、光学系を変えることも検討する

細胞の移動や分裂を観察したい場合、別の色素を導入すると観察が複雑になることがあります。Nikonが透明試料のコントラストに関するガイドで説明しているように、位相差法と微分干渉法（DIC）は、試料の光学的性質の違いを利用して可視化します。顕微鏡に必要な構成要素が備わっていれば、生きた無染色細胞を観察できます。

この方法では無染色の試料を維持できますが、得られる情報は変わります。境界や動きを追跡することはできますが、どの分子がそのコントラストを生じさせたのかは分かりません。分子の局在を知ることが目的であれば、適切な標識法を選択してください。

核DNAについては、InvitrogenのDAPIとHoechst染色の比較で、固定細胞に一般的に使用されるDAPIと、細胞透過性がより高く、生細胞標識に適したHoechst 33342が区別されています。どちらにも蛍光観察装置が必要です。どちらも、明視野で使用する有色染色剤を直接置き換えるものではありません。

色素への曝露と照明条件は、実験条件として扱ってください。細胞の挙動そのものを測定する場合は、染色試料と無染色試料を比較します。

赤い細胞が自動的に死細胞を意味するわけではない

SYTO 9とヨウ化プロピジウムは、細菌膜の完全性を評価する目的で併用されることがあります。BacLightマニュアルでは、膜が保たれている場合を緑色染色、損傷した膜を赤色染色と関連付けています。ただし、その解釈は対象試料について妥当性を確認する必要があります。

Rosenbergらによる2019年の研究は、この問題を示しています。リン酸緩衝生理食塩水中でガラス上に形成した24-hour E. coli バイオフィルムでは、in situで約96%の細胞がヨウ化プロピジウム陽性に見えました。しかし著者らは、回収後には82%が培養可能であったと推定しています。共焦点画像では、赤く染色された物質の下に内部が緑色の細胞が確認され、細胞外核酸が誤解を招くシグナルに関与していることが示唆されました。

これらの割合は、その研究の試料に対して異なる測定法で得られた値であり、普遍的な補正係数ではありません。重要なのは、何がシグナルを発生させたのかを確認することです。バイオフィルムでは、核酸色素は損傷細胞内だけでなく、細胞外の物質も検出することがあります。生存性について結論を出す場合、研究者らは、培養や代謝活性などの補完的な測定を推奨していますが、それぞれに制約があることも認めています。

代替法に実際に何が含まれているか確認する

代替となる染色法にも、メチレンブルーが含まれている場合があります。Giemsaがその一例です。Merckは自社製品をアズール-エオシン-メチレンブルー溶液と説明しており、血液塗抹標本や骨髄塗抹標本などへの使用を想定しています。異なる試料に対する異なる方法にはなり得ますが、メチレンブルーを除外するという要件は満たしません。

化合物を除外することが実験条件の一部である場合、画像を比較する前に試薬の同一性と処方を確認してください。methyl blue、methylene blue、および名称が似た色素のガイドでは、名称上の違いを解説しています。

結果を利用する前に置換法を検証する

新しい方法を使用する場合は、代表的な試料と適切な対照を用いて、小規模な比較を行います。可能な範囲で顕微鏡の設定を比較可能な状態に保ちます。試薬処方、試料調製、曝露条件、イメージング条件を記録し、単に見栄えのよい画像を選ぶのではなく、なぜその画像が良く見えるのかを検討できるようにします。

元の観察目的に照らして成否を判断してください。形態については、細胞境界と配列を引き続き解釈できるかを評価します。核標識については、シグナルの位置と背景を評価します。生存性については、見栄えのよい色の分離だけではなく、追加の根拠を必要とします。より広範なガイドであるメチレンブルー染色と研究室での応用では、観察内容と試料調製の関係を説明しています。

必要な測定を維持できる代替法を選択してください。色は、得られる画像を構成する性質の1つにすぎません。