Misurare gli effetti mitocondriali del blu di metilene: ossigeno, ATP e potenziale di membrana

Supponiamo che un laboratorio aggiunga blu di metilene a mitocondri con respirazione compromessa e osservi un aumento del consumo di ossigeno. Verrebbe naturale scrivere che il colorante ha ripristinato la funzione mitocondriale. Questa frase potrebbe essere sbagliata. Il flusso di ossigeno, la sintesi di ATP e il potenziale di membrana sono tre concetti distinti. Condividono lo stesso organello come backup, sincronizzazione e condivisione condividono la stessa cartella nel cloud: sono correlati, ma regolati da meccanismi diversi. Confonderli compromette l'interpretazione, anche quando ogni misurazione è tecnicamente corretta.

Il blu di metilene rende probabile questa confusione perché partecipa al sistema che misura. È un composto che compie cicli redox, accettando elettroni a monte e cedendoli a valle, un catione lipofilo che si accumula nei mitocondri energizzati e un composto di colore blu intenso che assorbe ed emette luce nelle stesse bande delle sonde comuni. Una sola misura non può rendere conto di tutto questo. L'approccio affidabile, emerso dagli studi mitocondriali di Budapest, consiste nel misurare il flusso di ossigeno insieme alla velocità di sintesi dell'ATP, al potenziale di membrana e al rilascio di perossido di idrogeno, con controlli specifici per il colorante a ogni passaggio.

La respirometria misura il flusso di ossigeno, non la produzione di energia

La respirometria ad alta risoluzione, eseguita con Oroboros Oxygraph o con l'analizzatore di flusso extracellulare Seahorse, indica una sola cosa: la velocità con cui l'ossigeno viene ridotto. Non indica quanti protoni siano stati pompati per elettrone, quanto gradiente sia stato conservato o se l'ATP sintasi lo abbia utilizzato.

La terminologia conta. Nei mitocondri isolati, il substrato senza ADP determina la respirazione di perdita protonica, il substrato con ADP a concentrazione saturante determina la capacità di fosforilazione ossidativa e la titolazione con un disaccoppiante determina la capacità massima di trasferimento elettronico. Nelle cellule intatte, le misure equivalenti di Seahorse sono la respirazione basale, la respirazione legata all'ATP sensibile all'oligomicina, la perdita protonica, la respirazione massima definita con FCCP e il consumo di ossigeno non mitocondriale resistente a rotenone e antimicina. Chiamare i risultati di Seahorse Stato 3 e Stato 4 attribuisce loro una precisione che la preparazione non consente, come chiarisce il quadro del Mito Stress Test di Agilent.

Il blu di metilene rompe il legame intuitivo tra più ossigeno e più energia. Nei mitocondri isolati dal cervello di cavia, il colorante a concentrazioni da 100 nM a 1 uM ha aumentato il consumo di ossigeno a riposo con glutammato più malato, succinato e alfa-glicerofosfato come substrati, con un aumento di circa il 64 percento con alfa-glicerofosfato; tuttavia, la respirazione stimolata dall'ADP nei mitocondri sani è rimasta sostanzialmente invariata, secondo lo studio sui mitocondri cerebrali isolati. Poiché la respirazione di perdita è aumentata mentre il flusso stimolato dall'ADP è rimasto stabile, il rapporto di controllo respiratorio calcolato diminuisce. Questa diminuzione non significa che il colorante abbia danneggiato i mitocondri. Significa che il colorante ha aggiunto un ciclo redox che consuma ossigeno alla respirazione normale. Un saggio del consumo di ossigeno con blu di metilene che riporti soltanto l'aumento ha misurato una reazione chimica reale, senza dire nulla sulla conservazione dell'energia.

Gli esperimenti di recupero mostrano lo stesso divario su scala maggiore. Con il Complesso I bloccato, il flusso di ossigeno è aumentato di circa tre volte, mentre la sintesi di ATP è aumentata solo di circa 1.5 volte. Più ossigeno ha raggiunto l'elettrodo. Una quota minore ha contribuito alla produzione di ATP. Qualsiasi affermazione di miglioramento della fosforilazione ossidativa richiede anche dati sull'ATP, idealmente espressi come rapporto ATP/ossigeno, specificando la convenzione usata per il denominatore.

I saggi dell'ATP misurano la velocità di sintesi, che il contenuto non può sostituire

Un saggio dell'ATP risponde a una domanda diversa: quanto ATP viene generato per unità di tempo. Una misura cinetica, ottenuta seguendo per alcuni minuti la luminescenza della luciferasi di lucciola oppure mediante un saggio accoppiato con esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi letto a 340 nm, fornisce una velocità. Una singola misurazione finale dell'ATP totale fornisce invece il contenuto, che riflette la sintesi meno il consumo e, da solo, dice poco sulla fosforilazione ossidativa.

Il gruppo di Budapest ha utilizzato il metodo enzimatico accoppiato con l'adenilato chinasi inibita e ha rilevato che il blu di metilene a 1–2 uM aumentava modestamente ma significativamente la produzione di ATP nei mitocondri trattati con rotenone e antimicina. È un recupero reale, ed è parziale. Lo studio sulla tossicità del TEGDMA ha ottenuto un risultato analogo in un modello diverso: il monomero dentale TEGDMA a 5 mM ha ridotto drasticamente la respirazione legata al Complesso I da circa 286 a 28 unità di flusso, e il colorante a 2 uM l'ha riportata a circa 86.

Con un composto colorato redox-attivo, due controlli sono imprescindibili. Primo, usare l'oligomicina per stabilire quanta parte della sintesi di ATP misurata dipenda dall'ATP sintasi. Secondo, eseguire una prova di recupero dell'ATP aggiunto in un sistema privo di cellule, con una quantità nota di ATP, il reagente completo e le esatte concentrazioni di colorante utilizzate, almeno 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM. Il colorante può assorbire la luce emessa, inibire l'enzima di rilevazione o alterare la chimica redox del reagente; le indicazioni generali sui saggi con luciferasi raccomandano saggi biochimici di controverifica proprio per questa classe di interferenze. Non presumere che 1 uM sia privo di artefatti solo perché lo spegnimento della fluorescenza è solitamente maggiore a concentrazioni più elevate.

Le sonde del potenziale di membrana misurano la distribuzione del colorante, non il flusso

La safranina O, TMRM e TMRE, la rodamina 123 e JC-1 sono tutti cationi permeanti la membrana. Si accumulano nella matrice carica negativamente secondo l'equilibrio elettrochimico, quindi la fluorescenza complessiva indica il potenziale indirettamente, attraverso la posizione della sonda. Nessuna di queste sonde misura l'ATP o il flusso elettronico.

Ogni sonda ha una preparazione preferenziale. La safranina O è adatta ai mitocondri isolati e alle cellule permeabilizzate, in genere a circa 2 uM, con eccitazione intorno a 495 nm ed emissione intorno a 585 nm, operando in un regime di spegnimento della fluorescenza in cui l'accumulo modifica la fluorescenza complessiva. TMRM e TMRE sono adatti alle cellule intatte con un caricamento a basse concentrazioni nanomolari, in modalità senza spegnimento della fluorescenza: la depolarizzazione rilascia il colorante e la fluorescenza mitocondriale diminuisce; con un caricamento elevato, la direzione del segnale può invertirsi per autospegnimento. JC-1 fornisce un comodo rapporto verde/rosso, ma dipende dal caricamento e dalla massa mitocondriale, risultando quindi meno adatto al lavoro quantitativo rispetto a TMRM con controlli accurati. Questi compromessi sono riassunti in una rassegna sulle sonde del potenziale di membrana mitocondriale ampiamente utilizzata.

Il blu di metilene interferisce otticamente proprio alle concentrazioni di lavoro. Le sue bande di assorbimento tra circa 600 e 665 nm si sovrappongono all'emissione rossa delle sonde, quindi gli effetti di filtro interno, lo spegnimento della fluorescenza e l'assorbimento della luce di eccitazione sono tutti plausibili. Il colorante è inoltre un secondo catione lipofilo, la cui distribuzione cambia con il potenziale che si sta misurando. La difesa consiste in misure ridondanti e bianchi: sonda da sola, colorante da solo, sonda con ogni concentrazione di colorante, depolarizzazione completa con FCCP come riferimento zero e, idealmente, una seconda sonda otticamente distinta. Lo studio sul bypass del Complesso III ha stabilito questo precedente ripetendo la misurazione del recupero del potenziale di membrana sia con safranina O sia con TMRM dopo l'inibizione con antimicina e mixotiazolo, ottenendo lo stesso recupero qualitativo. Un solo indicatore ottico è un indizio. Due indicatori indipendenti costituiscono una prova.

Tre preparazioni, tre domande diverse

Mitocondri isolati, cellule permeabilizzate e cellule intatte non sono impostazioni di sensibilità intercambiabili di uno stesso saggio. Sono approcci diversi, con principi operativi diversi.

I mitocondri isolati conservano la catena di trasporto degli elettroni, la membrana interna e l'apparato della matrice, mentre vengono rimossi la membrana plasmatica, il citosol e l'architettura della rete. Questa rimozione è il punto centrale: substrati, ADP, inibitori e concentrazioni di colorante sono definiti con esattezza, quindi è possibile identificare una via. Il prezzo è la perdita dell'apporto nativo di substrati, della segnalazione e della domanda energetica.

Le cellule permeabilizzate mantengono i mitocondri all'interno di gran parte della loro architettura cellulare, consentendo al contempo il passaggio di substrati esogeni e ADP attraverso la membrana plasmatica resa permeabile. Sono lo strumento adatto per identificare un difetto di una via legata a un substrato nel contesto cellulare. Una permeabilizzazione eccessiva danneggia la membrana esterna, e la regolazione citosolica viene persa durante il lavaggio.

Le cellule intatte conservano tutto: la barriera della membrana plasmatica, i riducenti citosolici, il trasporto endogeno dei substrati, la rete mitocondriale e la richiesta di ATP. Sono le più vicine alla fisiologia e le più lontane dal meccanismo, perché l'assorbimento, la riduzione e il sequestro del colorante determinano tutti l'esposizione mitocondriale effettiva.

Lo studio sul TEGDMA ha utilizzato deliberatamente tutti e tre i livelli: mitocondri cerebrali isolati per il recupero dell'ossidazione e del potenziale mediante il colorante, cellule staminali della polpa dentale permeabilizzate soprattutto per localizzare l'alterazione nell'ossidazione dei substrati legata al Complesso I, e cellule staminali intatte per l'effetto fisiologico netto del colorante a 2 uM sul consumo di ossigeno soppresso. Per chi confronta le misure mitocondriali tra preparazioni, l'articolo di approfondimento su come il blu di metilene trasferisce gli elettroni attraverso la catena respiratoria fornisce il contesto delle vie coinvolte, mentre la guida alla lettura degli studi sulla respirazione con blu di metilene illustra la logica delle dosi e degli inibitori.

I controlli richiesti da un colorante redox-attivo

Un composto che compie cicli redox richiede una lista di controlli più lunga rispetto a un normale inibitore, perché la chimica del solo colorante può imitare la biologia.

Per la respirometria, utilizzare una camera con il solo tampone per valutare la deriva, una camera con tampone e colorante senza materiale biologico, il colorante con qualsiasi riducente extracellulare presente nel saggio e, alla fine, rotenone più antimicina per definire il consumo di ossigeno non mitocondriale nelle cellule intatte. Va ricordato che il colorante ridotto si riossida trasferendo elettroni all'ossigeno e formando perossido di idrogeno: un bianco con il solo colorante, senza un donatore di elettroni, sottostima quindi il consumo di ossigeno non cellulare che si manifesta quando sono disponibili NADH o NADPH.

Per il perossido di idrogeno, preferire Amplex UltraRed calibrato con perossidasi di rafano ai coloranti non selettivi DCFDA, verificare con catalasi e controllare la dipendenza dall'illuminazione, poiché il colorante è un fotosensibilizzante. Lo studio sui mitocondri cerebrali ha rilevato che il carico di perossido aumentava di oltre quattro volte già con il colorante a 100 nM, mentre la sua eliminazione rallentava; il perossido si formava direttamente dal colorante ridotto, senza un intermedio superossido. I dettagli sulla scelta delle sonde e sui controlli della luce sono trattati nell'articolo di approfondimento sulla misurazione delle specie reattive dell'ossigeno negli esperimenti con coloranti, mentre la questione più ampia di quando il perossido agisca come segnale e quando rappresenti un carico è affrontata insieme all'equilibrio redox cellulare e alle affermazioni sugli antiossidanti.

Per le affermazioni sulle vie coinvolte, verificare entrambi i siti di inibizione del Complesso III: antimicina A al sito Qi e mixotiazolo al sito Qo, più un controllo finale del Complesso IV con cianuro. Un precedente studio sul cervello di topo aveva riportato un recupero, mediante il colorante, della respirazione bloccata dal rotenone ma non di quella bloccata dall'antimicina; il successivo studio su tre specie ha invece rilevato un recupero parziale con entrambi gli inibitori e indizi di una riduzione diretta del citocromo c. Considerare il bypass compatibile con i dati più recenti, anziché definitivamente dimostrato, poiché la concentrazione del colorante, il sito di inibizione, lo stato dei substrati e la distribuzione del colorante modificano tutti la via osservata.

Matrice di selezione dei saggi

Usare questa tabella per scegliere la misurazione in base alla domanda, non il contrario.

Il requisito minimo per un'affermazione convincente consiste nell'utilizzare le stesse concentrazioni di colorante, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM, per misurare il flusso di ossigeno in condizioni di perdita protonica, con ADP, con oligomicina e con disaccoppiante, la velocità di sintesi dell'ATP, il potenziale di membrana preferibilmente con due sonde e il rilascio di perossido calibrato con catalasi e controlli privi di cellule. Riportare l'insieme delle misure collegate: flusso di ossigeno più velocità di sintesi dell'ATP più ATP per ossigeno più potenziale più perossido. Ognuno di questi numeri, da solo, è una misurazione in cerca di un significato.