Colorazione delle cellule della guancia con blu di metilene: cosa osservare

Una studentessa deposita una goccia di sospensione di cellule della guancia su un vetrino, guarda nel microscopio e non vede quasi nulla. Qualche sagoma pallida fluttua su un campo luminoso. Regola la messa a fuoco, poi aumenta la luce, infine conclude che il vetrino è vuoto. Il vetrino non è vuoto. Le cellule ci sono. Sono quasi trasparenti, e la trasparenza è proprio il problema che questa colorazione serve a risolvere.

Vale la pena chiarire questa discrepanza tra aspettativa e immagine prima di iniziare il protocollo. I principianti si aspettano che un microscopio riveli i dettagli come lo zoom di una fotocamera rende leggibile un cartello lontano. Un microscopio a campo chiaro fa qualcosa di più circoscritto: mostra differenze nell'assorbimento della luce. Una cellula della guancia non colorata non assorbe quasi nessuna luce, quindi genera una differenza quasi impercettibile. Il blu di metilene aggiunge questa differenza. Si lega all'interno della cellula in modo non uniforme e trasforma la struttura in contrasto. Una volta compreso questo concetto, ogni passaggio successivo appare come una conseguenza, anziché come una ricetta.

È utile conoscere come le colorazioni semplici aumentano il contrasto nel laboratorio scolastico, e un ripasso su come preparare un microscopio a campo chiaro prima della colorazione evita metà dei preparati mal riusciti. La chimica alla base del colore è trattata in un'introduzione al blu di metilene in microscopia, che spiega perché questo particolare colorante ricorre così spesso sul banco di laboratorio.

Il protocollo didattico

La versione con preparato a fresco riportata di seguito è l'opzione più semplice per le normali attività in classe. Non richiede né una fiamma né una fase di fissazione. La variante con striscio fissato, utilizzata in alcuni manuali universitari, aggiunge l'asciugatura all'aria e una breve fissazione al calore, come nell'attività sullo striscio di cellule della guancia del North Central Texas College pubblicata su Biology LibreTexts, ma la fissazione al calore è una prassi microbiologica, non un requisito per osservare le cellule epiteliali.

Occorrente: vetrini portaoggetti e coprioggetti puliti, tamponi sterili monouso (preferibili) oppure stuzzicadenti piatti nuovi, un flacone contagocce di blu di metilene in soluzione acquosa dallo 0.5 all'1 percento, acqua distillata o deionizzata, carta assorbente, guanti e un microscopio composto con ingrandimento totale di 100x e 400x.

1. Sciacquare la bocca con sola acqua. Questo rimuove le particelle di cibo che in seguito si colorerebbero intensamente, distogliendo l'attenzione dalle cellule.
2. Ogni studente preleva il campione soltanto dalla propria guancia. Strofinare delicatamente l'interno della guancia con un tampone sterile nuovo. Premere, senza raschiare. Fermarsi ben prima di avvertire fastidio o provocare sanguinamento.
3. Far rotolare il tampone sulla parte centrale di un vetrino pulito, distribuendo il materiale in uno strato sottile. Uno strato sottile è il fattore che più di ogni altro determina la leggibilità del preparato. Un deposito bianco spesso, una volta colorato, diventerà una massa blu illeggibile.
4. Aggiungere una goccia di blu di metilene sullo striscio. Lasciare agire da 1 a 3 minuti. In molti protocolli universitari basta un minuto; il manuale di laboratorio di scienze NCERT per la classe IX prevede circa 3 minuti per un preparato temporaneo. Un tempo più lungo non dà risultati migliori, e la sovracolorazione è l'errore più comune nella gestione dei tempi.
5. Risciacquare delicatamente con acqua distillata oppure assorbire il colorante in eccesso con carta assorbente, seguendo il protocollo locale. Lo sfondo dovrebbe diventare azzurro pallido, non blu scuro.
6. Abbassare il coprioggetto tenendolo inclinato, in modo che tocchi prima un bordo, quindi lasciarlo scendere lentamente. Questo evita la formazione di bolle d'aria.
7. Iniziare a basso ingrandimento per individuare le cellule, verificare la messa a fuoco e la centratura, quindi passare a 100x e infine a 400x. A 400x usare soltanto la regolazione micrometrica della messa a fuoco.

La concentrazione del colorante merita una precisazione. I protocolli scolastici si attestano generalmente intorno all'1 percento di blu di metilene in soluzione acquosa. Una soluzione madre più concentrata o un'esposizione prolungata scuriscono lo sfondo più rapidamente del nucleo, invertendo il contrasto su cui si basa l'esercizio.

Manipolare in sicurezza il materiale prelevato dalla guancia

I campioni della guancia contengono saliva e i normali microrganismi del cavo orale, quindi ogni striscio fresco va trattato come materiale potenzialmente infettivo, anche se proviene da compagni di classe sani. Le linee guida di biosicurezza dell'American Society for Microbiology per i laboratori didattici indicano i principi generali: valutare il rischio prima dell'attività, indossare guanti, proteggere gli occhi quando sono possibili schizzi, lavarsi le mani al termine, disinfettare i banchi e smaltire i materiali monouso contaminati attraverso il percorso approvato per i rifiuti biologici.

Quattro regole per la classe coprono la maggior parte dei rischi. Un solo donatore per tampone e per vetrino, senza mai condividerli. Solo autoprelievo, mai prelevare un campione da un compagno. Tamponi e stuzzicadenti monouso vanno direttamente nel contenitore dei rifiuti designato, mai di nuovo sul banco. Il blu di metilene macchia la pelle e gli indumenti e irrita gli occhi, quindi occorrono guanti e le normali precauzioni igieniche per l'uso dei coloranti. Non estendere questo esercizio alla coltura di materiale proveniente dallo striscio e non improvvisare la fissazione al calore di materiale umano fresco al di fuori della procedura di sicurezza scolastica.

Cosa osservare e perché ha questo aspetto

A 100x, cercare cellule ampie e piatte, azzurro pallido, con contorni ovali irregolari o poligonali. Si presentano isolate oppure in gruppi poco compatti di cellule sovrapposte. Ogni cellula mostra solitamente una macchia blu più scura. Quella macchia è il nucleo. Osservare anche la disposizione: le cellule epiteliali pavimentose sono tessere sottili, non sfere, ed è per questo che i loro bordi ricordano uno smalto screpolato più che palloncini rotondi.

A 400x si distinguono chiaramente tre elementi. Il contorno cellulare appare come una sottile linea più scura che racchiude la cellula. Il citoplasma riempie l'interno con un azzurro chiaro uniforme. Il nucleo appare più scuro e compatto, spesso ovale, solitamente vicino al centro, ma non sempre. Chiedere agli studenti di annotare tutti e tre gli elementi, insieme alla forma e all'ingrandimento, perché è esattamente ciò che richiede la scheda.

Qui è importante una precisazione che molte schede didattiche trascurano. Il contorno visibile corrisponde alla regione della membrana plasmatica, ma la membrana stessa, un doppio strato lipidico spesso circa da 7 a 10 nanometri, è molto al di sotto del limite di risoluzione di un microscopio scolastico. Ciò che gli studenti vedono è il bordo ottico della cellula, insieme al colorante accumulato in quella zona. La stessa cautela vale per gli organelli. Mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi e ribosomi non sono visibili in questo preparato. In buone condizioni, un microscopio ottico convenzionale arriva a risolvere dettagli di circa 0.2 micrometri, come spiega l'approfondimento NCBI di biologia cellulare sugli strumenti di microscopia, e gran parte dell'ultrastruttura si trova al di sotto o vicino a quel limite. Un ulteriore ingrandimento a vuoto rende l'immagine più grande senza aggiungere dettagli.

Perché il nucleo si colora più intensamente? Il blu di metilene è un colorante cationico, con carica positiva in soluzione, e si associa a materiale con carica negativa nella cellula, soprattutto agli acidi nucleici. La cromatina concentra il DNA nel nucleo, quindi il nucleo accumula la maggior quantità di colorante. Il citoplasma contiene RNA e altre molecole cariche, perciò si colora anch'esso, ma in modo più diffuso e meno intenso. La precisazione fondamentale è che il blu di metilene non è un colorante specifico per il DNA. Uno studio sulla distribuzione del blu di metilene nell'imaging nucleare descrive l'associazione del catione con regioni ricche di acidi nucleici, e un precedente studio quantitativo sul legame del blu di metilene nei preparati cellulari ha rilevato che la maggior parte del colorante legato era associata agli acidi nucleici. Un nucleo scuro e un citoplasma chiaro costituiscono quindi un pattern di contrasto, non un saggio molecolare.

Gli errori che faranno gli studenti e come interpretarli

Quasi tutti i preparati mal riusciti rientrano in uno di cinque schemi. Insegnare agli studenti a individuare il problema del preparato, anziché ripeterlo alla cieca.

La sovracolorazione rende cellule e sfondo uniformemente scuri, così il nucleo si perde nel campo. Per correggerla, ridurre il tempo di colorazione o risciacquare più accuratamente. Una colorazione insufficiente lascia sagome pallide che scompaiono quando si aumenta la luce; prolungare il tempo a intervalli di trenta secondi. Gli strisci spessi producono masse dense e sovrapposte in cui non è possibile distinguere alcun contorno; la correzione è meccanica: la volta successiva distribuire il materiale in uno strato più sottile, perché nessun risciacquo può recuperare un accumulo di cellule. Le bolle d'aria appaiono come cerchi perfetti con bordi scuri e netti e distraggono i principianti, che le scambiano per strutture; riposizionare lentamente il coprioggetto tenendolo inclinato. I minuscoli punti scuri sparsi sulle cellule o intorno a esse sono solitamente normali batteri orali, come segnalano protocolli scolastici quali la procedura di Ingrid Science per le cellule della guancia. Confermano che la bocca è abitata, un fatto che può colpire gli studenti, ma in questo esercizio non è possibile identificarne la specie e non vanno disegnati come parti della cellula. I residui di cibo e i filamenti di muco si colorano in modo irregolare e intenso; il risciacquo iniziale serve a ridurli.

Cosa non può fare questo esercizio

Si tratta di un'osservazione didattica, non di un test diagnostico. Nessun aspetto delle cellule in una colorazione eseguita in classe consente di diagnosticare infezioni, tumori o qualsiasi malattia, e questo articolo non deve essere interpretato come un'affermazione del contrario. Il preparato mostra forma, contorno, citoplasma e nucleo a due ingrandimenti. Non mostra l'ultrastruttura della membrana, i dettagli degli organelli o l'identità molecolare. Esplicitare questo limite tutela sia il rigore scientifico sia gli studenti: un buon risultato è un disegno correttamente annotato, con indicazione dell'ingrandimento e della colorazione, non una conclusione sulla salute.

Scheda per gli studenti e micrografie annotate

Le due risorse del progetto per questa pagina sono la micrografia annotata riportata sopra e la scheda qui sotto. Stampare una scheda per ogni studente oppure proiettarla e chiedere agli studenti di copiarne i riquadri sul quaderno.

Come usarla in una sessione di 45 minuti: dieci minuti per le istruzioni di sicurezza e il prelievo, dieci minuti per la colorazione e il montaggio, quindici minuti per l'osservazione e il disegno a entrambi gli ingrandimenti, dieci minuti per la lista di controllo e il confronto con la micrografia annotata. Le voci della lista di controllo sono volutamente operative. Striscio sottile, tempo di colorazione corretto, nucleo più scuro del citoplasma, ingrandimento annotato. Uno studente che può spuntare tutte e quattro ha compreso il concetto che la lezione vuole insegnare: i microscopi mostrano differenze e le colorazioni creano le differenze che vale la pena mostrare.