Blu di metilene e ossido nitrico: NOS, cGMP e segnalazione vascolare

La domanda sembra semplice: il blu di metilene inibisce l'ossido nitrico? In laboratorio, la risposta si articola in quattro domande separate, ciascuna con una diversa verifica sperimentale. Confonderle è il motivo principale per cui i testi sul blu di metilene e sull'ossido nitrico appaiono sicuri ma vaghi.

Immaginiamo il segnale dell'ossido nitrico come una catena con quattro anelli. Un gene viene trascritto per produrre l'ossido nitrico sintasi. L'enzima converte l'arginina in ossido nitrico. Il gas diffonde fino al suo bersaglio prima di reagire con qualcos'altro. La guanilato ciclasi solubile lo rileva e produce GMP ciclico. Per il blu di metilene sono stati pubblicati effetti su ogni anello, ma le evidenze provengono da preparazioni, concentrazioni e isoforme diverse. Un risultato relativo a un anello non dimostra un'azione su un altro.

La catena canonica, spiegata con chiarezza

Nella parete di un vaso sanguigno, la sequenza standard si svolge così. Uno stimolo agisce su una cellula endoteliale. L'ossido nitrico sintasi endoteliale, chiamata eNOS o NOS3, produce un piccolo impulso di ossido nitrico. Il gas diffonde nella cellula muscolare liscia vicina, si lega all'eme con ferro ridotto della guanilato ciclasi solubile e accelera la conversione del GTP in GMP ciclico. Il GMP ciclico attiva la protein chinasi G, la gestione del calcio cambia e il muscolo si rilassa.

Esiste una seconda catena che vale la pena tenere distinta. Durante un'infezione o l'esposizione a citochine, le cellule trascrivono un enzima diverso, l'ossido nitrico sintasi inducibile o iNOS, chiamata anche NOS2. Questa produce flussi di ossido nitrico maggiori e più duraturi rispetto a eNOS. Una terza isoforma, la NOS neuronale o nNOS, appartiene a un altro contesto ancora. Quando un articolo parla di ossido nitrico sintasi senza specificare l'isoforma, fermatevi e verificate quale sia stata misurata. La panoramica su come il blu di metilene trasferisce elettroni sottolinea lo stesso punto per i bersagli redox in generale: il sistema di trasferimento non fa nulla da solo, e il partner a ciascuna estremità determina il risultato.

Anche il GMP ciclico misurato è un indicatore integrato, non un saggio enzimatico diretto. Il suo livello riflette la sintesi da parte della ciclasi meno la degradazione da parte delle fosfodiesterasi, soprattutto PDE5 nella muscolatura liscia vascolare. Una diminuzione del GMP ciclico significa quindi che al rilevatore è arrivato meno segnale. Da sola, non identifica l'anello che ha ceduto.

Anello 1: viene prodotto meno enzima iNOS

Nei macrofagi di topo stimolati con lipopolisaccaride batterico, interferone gamma o entrambi, il blu di metilene ha impedito l'aumento atteso della proteina iNOS e ha fortemente soppresso l'RNA messaggero di iNOS negli esperimenti sulla trascrizione nei macrofagi. L'aspetto informativo è ciò che non è cambiato. La degradazione dell'inibitore I kappa B alfa, la fosforilazione di NF kappa B e STAT1 e il trasferimento di questi fattori nel nucleo sono rimasti sostanzialmente intatti. A diminuire è stato il loro legame al DNA, come confermato dall'immunoprecipitazione della cromatina, che ha mostrato una ridotta occupazione del promotore di iNOS.

Si tratta di un effetto di regolazione genica a monte della quantità di enzima, non del blocco acuto di un enzima già presente. Riguarda la segnalazione infiammatoria, nella quale i fattori di trascrizione devono legarsi a un promotore prima che compaia la proteina. Non dice nulla di diretto sulla eNOS costitutiva in un vaso a riposo, e va descritto in questi termini.

Anello 2: l'enzima NOS già presente lavora più lentamente

Uno studio sui ratti ha esaminato un livello diverso. Ratti maschi coscienti hanno ricevuto lipopolisaccaride per via endovenosa e, tre ore dopo, soluzione salina oppure blu di metilene a 3 mg per kg per via endovenosa. L'attività dell'ossido nitrico sintasi nell'ipotalamo medio-basale è stata poi misurata mediante la conversione dell'arginina marcata in citrullina nello studio sull'attività della NOS ipotalamica. Lo stress associato alla sola soluzione salina ha indotto una certa attività indipendente dal calcio, e il lipopolisaccaride l'ha portata a circa dieci volte il livello di controllo. Il blu di metilene ha eliminato entrambe le componenti indotte. L'attività costitutiva dipendente dal calcio non è cambiata in quel tessuto, a quella dose e in quel momento di misurazione.

Leggete quel risultato esattamente per ciò che afferma: soppressione dell'attività misurata di tipo iNOS in quelle condizioni. Non è una misurazione dell'espressione genica e non dimostra una selettività permanente per iNOS rispetto a eNOS o nNOS. Gli studi su enzimi purificati rafforzano questa cautela. Nei saggi diretti sull'ossido nitrico sintasi purificata, il blu di metilene ha bloccato completamente la formazione di citrullina a 30 micromolare, con una concentrazione di inibizione del 50% vicina a 5.3 micromolare senza superossido dismutasi e a 9.2 micromolare in sua presenza, come riportato nel confronto tra NOS e guanilato ciclasi purificate. Uno studio separato sulla nNOS purificata ha indicato il coinvolgimento dell'ossidazione dell'eme legato all'enzima. La lezione pratica è che l'inibizione diretta della NOS è reale nei sistemi isolati, ma il risultato sull'ipotalamo non può essere esteso a un'affermazione generale secondo cui il blu di metilene risparmia tutte le NOS costitutive ovunque.

Anello 3: l'ossido nitrico viene perso prima di arrivare

La dimostrazione più chiara che qualcosa di diverso dal blocco enzimatico può spiegare una diminuzione del GMP ciclico proviene da cellule muscolari lisce dell'arteria polmonare di coniglio in coltura. Il disegno sperimentale ha aggirato del tutto la NOS endogena aggiungendo direttamente donatori di ossido nitrico, per poi verificare se il blu di metilene sopprimesse comunque la risposta del GMP ciclico nello studio sul superossido nella muscolatura liscia vascolare.

Sono stati testati tre donatori da 1 a 100 micromolare: S-nitroso-L-cisteina, nitroprussiato di sodio e un analogo deaminato stabile chiamato MPANO. Tutti hanno aumentato il GMP ciclico da circa 1.5 a 12 volte. Il blu di metilene a 10 micromolare ha inibito i primi due dal 51 al 100 percento e ha lasciato invariata la risposta a MPANO. Se il blu di metilene bloccasse semplicemente il sito catalitico della ciclasi, questa selettività tra donatori sarebbe difficile da spiegare, perché tutti e tre convergono sullo stesso enzima a valle.

Tre controlli hanno poi attribuito il meccanismo al superossido. Primo, la generazione di superossido extracellulare con xantina e xantina ossidasi ha riprodotto lo stesso schema: CYSNO e nitroprussiato bloccati, MPANO risparmiato. Secondo, il blu di metilene ha provocato una produzione di superossido da parte delle cellule muscolari lisce dipendente dalla dose e dal tempo, misurata mediante la riduzione del citocromo c. Terzo, la superossido dismutasi ha impedito completamente l'inibizione, mentre la catalasi non l'ha fatto: ciò indica il superossido, anziché il perossido di idrogeno, come specie direttamente responsabile in quella preparazione.

Vale la pena descrivere la versione in co-coltura dell'esperimento perché localizza l'effetto nello spazio. Cellule endoteliali su vetrini coprioggetto sono state brevemente messe in co-coltura con cellule muscolari lisce, così che il fattore endoteliale rilasciato in condizioni basali aumentasse il GMP ciclico della muscolatura liscia da tre a otto volte. Il pretrattamento di uno qualsiasi dei due compartimenti con blu di metilene ha ridotto quel segnale, e la superossido dismutasi ha parzialmente contrastato l'effetto del pretrattamento endoteliale. In altre parole, non è affatto necessario che il blu di metilene agisca all'interno della cellula muscolare liscia che rileva il segnale. Può ridurre il segnale eliminando il messaggero durante il tragitto. La guida alla lettura della ricerca sul blu di metilene tratta questo principio come una regola generale: indicare il compartimento in cui è avvenuto l'intervento prima di indicare un bersaglio molecolare.

Definire questo fenomeno come inibizione della NOS sarebbe sbagliato. Perché i donatori funzionassero non era necessaria alcuna fase mediata dalla sintasi, eppure il segnale è comunque diminuito.

Anello 4: il rilevatore stesso risponde meno

Gli effetti diretti sulla guanilato ciclasi solubile esistono, ma le concentrazioni contano. Nel confronto tra enzimi purificati citato sopra, la ciclasi stimolata dall'ossido nitrico richiedeva circa 60 micromolare di blu di metilene per un'inibizione del 50%, contro circa 5–9 micromolare per la NOS, e persino 1 millimolare produceva soltanto un blocco massimo parziale. Si tratta di una differenza di circa sei-undici volte. Un esperimento cellulare a basse concentrazioni micromolari che riduce il GMP ciclico non può quindi essere definito un'inibizione selettiva della ciclasi basandosi soltanto sul valore del GMP ciclico.

Uno studio redox successivo ha aggiunto una seconda cautela: il blu di metilene disattivava la ciclasi attivata dall'ossido nitrico attraverso un meccanismo distinto dalla semplice ossidazione del ferro dell'eme dovuta all'aria. Il rilevatore può dunque essere compromesso, ma la chimica non è ancora chiarita, e la differenza di concentrazione implica che, a basse esposizioni micromolari, gli effetti del superossido e sulla NOS debbano essere esclusi per primi. È qui che trova posto anche il controllo delle fosfodiesterasi. A meno che la degradazione non sia stata misurata o bloccata, un ridotto accumulo di GMP ciclico è compatibile con una minore sintesi, una degradazione più rapida o entrambe.

Perché tutto questo non si riduce a una sola affermazione sulla pressione arteriosa

Ogni anello è stato dimostrato in un sistema diverso. La trascrizione nei macrofagi non è l'attività enzimatica ipotalamica. L'attività ipotalamica dopo il lipopolisaccaride non è il tono endoteliale a riposo. Il fattore endoteliale rilasciato in condizioni basali in co-coltura non è la vasodilatazione stimolata da un agonista. Le cellule dell'arteria polmonare in coltura esposte a blu di metilene a 10 micromolare non sono una circolazione umana. Ridurre tutto a un'affermazione come «il blu di metilene aumenta la pressione arteriosa bloccando l'ossido nitrico» elimina proprio le distinzioni che i controlli erano stati progettati per preservare.

Tre verifiche mantengono rigorosa la ricostruzione. Primo, indicare l'isoforma: eNOS per il tono vascolare a riposo, iNOS per il flusso infiammatorio indotto, nNOS per i contesti neuronali e alcuni studi su enzimi purificati. Secondo, indicare come viene fornito il segnale dell'ossido nitrico: sintesi endogena, rilascio endoteliale basale o un donatore specifico come CYSNO, nitroprussiato o MPANO, poiché il donatore stabile ha resistito al blu di metilene mentre quelli labili no. Terzo, indicare la concentrazione e il ripristino: il ripristino con superossido dismutasi implica il coinvolgimento del superossido; l'assenza di effetto della catalasi depone contro il perossido di idrogeno in quella preparazione; la riproduzione dell'effetto con xantina ossidasi dimostra che il meccanismo è sufficiente; i saggi su enzimi purificati separano gli effetti diretti sulla catalisi dalle perdite durante il tragitto.

La sintesi è questa. È più corretto considerare il blu di metilene come un agente che perturba in più punti la segnalazione dall'ossido nitrico al GMP ciclico, piuttosto che come un bloccante selettivo della ciclasi. A seconda della preparazione e della concentrazione, può ridurre il legame dei fattori di trascrizione di iNOS, inibire direttamente gli enzimi NOS, diminuire la disponibilità di ossido nitrico attraverso la generazione di superossido e compromettere la ciclasi attivata dall'ossido nitrico. Il ruolo della segnalazione del GMP ciclico negli studi vascolari e il confronto tra i donatori di ossido nitrico utilizzati nei saggi cellulari approfondiscono ciascuno uno di questi rami, mentre i metodi utilizzati per separare gli effetti redox dagli effetti enzimatici spiegano perché la combinazione di superossido dismutasi, catalasi e un controllo con un donatore stabile compaia così spesso in questa letteratura.

Un basso valore di GMP ciclico dopo il blu di metilene identifica una catena interrotta. Solo i controlli indicano quale anello si è spezzato.