Blu di metilene, Nrf2 e biogenesi mitocondriale: una spiegazione

Negli scritti sul blu di metilene ricorre spesso una frase: attiva Nrf2 e crea nuovi mitocondri. La frase sembra un'unica affermazione, ma racchiude due concetti diversi, studiati in sistemi diversi e con tipi di prove diversi. Il primo è una via di segnalazione, un sensore che attiva i geni di difesa. Il secondo è un programma di costruzione, con cui una cellula produce più apparato mitocondriale. Un segnale può avviare la costruzione, ma dimostrare che il segnale si è attivato non equivale a dimostrare che l'edificio è stato costruito, e osservare più materiale da costruzione non equivale a dimostrare un'alimentazione energetica migliore. Questo articolo mantiene separate queste tre cose.

Il concetto di Nrf2: un sensore, non uno scudo

Nrf2 (fattore nucleare eritroide 2-correlato 2) è un fattore di trascrizione, una proteina il cui compito è attivare i geni. In condizioni basali viene trattenuto nel citoplasma da una proteina sensore chiamata Keap1, che lo consegna all'apparato di smaltimento della cellula perché venga continuamente degradato. Quando ossidanti o elettrofili modificano le cisteine reattive di Keap1, lo smaltimento si interrompe. L'Nrf2 appena prodotto si accumula, entra nel nucleo, si associa a piccole proteine Maf e si lega a sequenze di DNA chiamate elementi di risposta antiossidante. Questo legame attiva un insieme di geni di difesa.

Gli indicatori canonici di questa via sono specifici. NQO1 (NAD(P)H chinone deidrogenasi 1) e TrxR1 (tioredossina reduttasi 1) sono tra i geni bersaglio di Nrf2 più affidabili. HO-1 (eme ossigenasi-1) è fortemente inducibile, ma risponde anche ad altri regolatori. Enzimi come SOD e catalasi fanno parte dell'apparato antiossidante, ma i loro livelli sono controllati da molti fattori di trascrizione: un aumento della SOD, quindi, non dimostra da solo che la causa sia Nrf2. Le prove più vicine all'evento di segnalazione sono l'accumulo nucleare di Nrf2, l'attivazione di un reporter ARE o l'induzione di bersagli canonici che scompare quando Nrf2 viene eliminato. Tutto il resto — livelli inferiori di ossidanti, migliore sopravvivenza sotto stress, più glutatione — è un effetto a valle che può essere prodotto da molte vie.

Il primo risultato sul blu di metilene in questa storia si colloca vicino a quell'estremità della scala. Fibroblasti esposti a blu di metilene a concentrazioni nanomolari hanno mostrato una senescenza ritardata, insieme a un maggiore contenuto di complesso IV, un maggiore consumo di ossigeno e l'induzione degli enzimi di fase 2 TrxR1 e NQO1, come riportato nello studio che per primo ha collegato il blu di metilene al potenziamento mitocondriale e al ritardo della senescenza. TrxR1 e NQO1 sono proprio i bersagli canonici di Nrf2 che un lettore attento vorrebbe vedere. Lo studio, però, non ha mostrato l'evento di segnalazione in sé: nessuna misurazione di Nrf2 nucleare, nessun reporter ARE, nessun controllo con knockout di Nrf2. La lettura corretta è quindi che, in questo sistema, il blu di metilene induce geni bersaglio noti di Nrf2: un risultato compatibile con l'attivazione di Nrf2, ma che non lo identifica in modo univoco come causa. L'induzione di un gene bersaglio si trova un passaggio a valle dell'interruttore.

Il concetto di biogenesi: un programma con tre punti di verifica

La biogenesi mitocondriale è il programma con cui una cellula aumenta la propria capacità mitocondriale. La sua gerarchia, secondo i manuali, attraversa tre punti di verifica. Primo, il coattivatore PGC-1alpha avvia il programma. Secondo, i fattori di trascrizione nucleari (uno dei quali, creando confusione, si chiama NRF1, fattore respiratorio nucleare 1, una proteina diversa da Nrf2) promuovono l'espressione di geni mitocondriali, tra cui TFAM, che mantiene e replica il DNA mitocondriale. Terzo, la cellula si ritrova con più genomi mitocondriali e più apparato respiratorio, misurabili come numero di copie del mtDNA, attività della citrato sintasi oppure abbondanza e attività dei complessi respiratori.

Ogni punto di verifica sostiene un'affermazione di forza diversa rispetto al precedente. Livelli più alti di RNA messaggero di PGC-1alpha o TFAM mostrano che il programma è stato richiesto, non che sia stato completato. Più mtDNA o più proteina del complesso IV indicano più materiale, ma anche mitocondri rimodellati possono presentare lo stesso quadro. Una respirazione migliore, un maggiore consumo di ossigeno o una maggiore attività dei complessi mostrano un cambiamento funzionale, ma la funzione può migliorare anche senza alcun nuovo mitocondrio. Un'affermazione solida di biogenesi combina tutti e tre gli elementi: regolatore, contenuto e funzione.

Lo studio successivo sui fibroblasti ha percorso gran parte di questa catena. Nelle cellule umane IMR90 trattate con blu di metilene a 100 nanomolari, il rapporto tra NAD e NADH è aumentato transitoriamente entro 15 minuti ed è tornato ai livelli basali entro un giorno. Questo segnale energetico transitorio è stato seguito da una fosforilazione transitoria del sensore energetico AMPK, poi dall'induzione di PGC-1alpha e di SURF1, una proteina necessaria per assemblare un complesso IV funzionante. L'attività del complesso IV è circa raddoppiata, gli ossidanti cellulari sono diminuiti di circa il 28 percento e i telomeri si sono erosi più lentamente. La sequenza completa è descritta nell'articolo che collega l'attività redox del blu di metilene ad AMPK e alla biogenesi mitocondriale.

Due dettagli di quell'articolo meritano attenzione, perché sono proprio il tipo di dettaglio che di solito viene omesso. Primo, la modalità contava più della semplice presenza: il blu di metilene attivava AMPK transitoriamente, mentre il farmaco di riferimento AICAR la attivava cronicamente, e l'attivatore transitorio ritardava la senescenza con un'efficacia circa otto volte maggiore. Un'affermazione come «il blu di metilene attiva AMPK» è quindi incompleta; l'affermazione rilevante è che attiva AMPK transitoriamente, e il confronto suggerisce che l'attivazione cronica non produca lo stesso effetto. Secondo, il blu di metilene non modificava il ciclo cellulare, escludendo così la spiegazione alternativa più banale: che le cellule si dividessero semplicemente più lentamente e, per questo, apparissero più giovani.

Il ramo murino: comportamento, genomi e un innesco volutamente paradossale

Il lavoro su colture cellulari è stato esteso agli animali da un gruppo che studiava topi di mezza età. Dopo 60 giorni di blu di metilene per via orale, i topi trattati conservavano meglio la resistenza fisica e il comportamento esplorativo e mostravano meno comportamenti simili all'ansia rispetto ai topi anziani non trattati. Nel tessuto cerebrale, l'espressione di geni che l'invecchiamento aveva ridotto — NRF1, TFAM, SOD2 e la subunità COX1 del complesso IV — è stata riportata verso i livelli dell'età adulta, e il numero di copie del mtDNA è aumentato. Questi risultati, che riguardano comportamento, regolatore e abbondanza genomica, sono riportati nello studio sui topi di mezza età dedicato al blu di metilene e alla biogenesi mitocondriale cerebrale.

L'innesco proposto è la parte interessante, perché contrasta con la semplice narrazione secondo cui il blu di metilene è un antiossidante. I topi trattati mostravano una maggiore produzione di specie reattive dell'ossigeno nei mitocondri cerebrali, in particolare di perossido di idrogeno. L'ipotesi degli autori è che sia un lieve segnale di perossido ad attivare la via di Nrf2, che a sua volta guida il programma di biogenesi. In questo modello il blu di metilene è pro-ossidante nella fase di innesco e antiossidante nella fase finale: uno schema che i farmacologi chiamano ormesi, in cui un piccolo stress provoca una risposta di difesa maggiore dello stress stesso. Non è stato verificato direttamente se quell'aumento del perossido causi davvero l'attivazione di Nrf2; è il collegamento ipotizzato, non un nesso misurato.

Uno studio complementare dello stesso gruppo ha messo alla prova l'aspetto della sicurezza di questa ipotesi. Nei mitocondri cerebrali isolati, il blu di metilene aumentava la produzione di perossido di idrogeno già a concentrazioni di 50 nanomolari, ma le concentrazioni terapeutiche non causavano danni rilevabili al DNA mitocondriale. Solo a 100 micromolari, molto al di sopra dei livelli terapeutici, alcuni frammenti selezionati di mtDNA mostravano danni, e la combinazione del colorante a 20 micromolari con luce rossa produceva ossigeno singoletto che danneggiava estesamente il mtDNA. Questo corrisponde al noto comportamento fotosensibilizzante del colorante, anziché alla sua farmacologia in assenza di luce. Il pretrattamento proteggeva persino i mitocondri del mesencefalo ventrale dalle lesioni del mtDNA indotte dal rotenone. La relazione dose-risposta e i controlli di genotossicità sono descritti nello studio sulla produzione non genotossica di perossido da parte del blu di metilene.

Misurato e ipotizzato: come leggere il diagramma

Il diagramma della via riportato qui sotto è stato realizzato per questo articolo per rendere esplicita la distinzione sviluppata nel testo. I riquadri con bordi continui rappresentano passaggi con supporto sperimentale diretto nella letteratura sul blu di metilene: cicli redox che modificano NAD/NADH, fosforilazione transitoria di AMPK, induzione di PGC-1alpha e SURF1, maggiore attività del complesso IV, induzione di NQO1 e TrxR1, ripristino dell'espressione dei geni della biogenesi e del numero di copie del mtDNA nel cervello murino, e aumento del perossido senza danni al mtDNA a dosi terapeutiche. I riquadri con bordi tratteggiati rappresentano i collegamenti ipotizzati: Keap1 che rileva il segnale del perossido, l'accumulo nucleare di Nrf2 che attiva i geni di difesa e la freccia causale dall'attivazione di Nrf2 al programma di biogenesi. Questi passaggi tratteggiati sono plausibili, coerenti con i dati e conformi alla biologia descritta nei manuali, ma in questi articoli non sono stati misurati con i controlli (Nrf2 nucleare, reporter ARE, knockout di Nrf2) che permetterebbero di rappresentarli con riquadri a bordo continuo.

Con il diagramma davanti, emergono tre possibili confusioni. Primo, NRF1 e Nrf2 sono proteine diverse con nomi quasi identici; lo studio sui topi ha misurato il fattore respiratorio nucleare 1, un regolatore della biogenesi, non il fattore di trascrizione antiossidante, e confonderli comprime l'intero diagramma in un unico nodo. Secondo, l'espressione genica è l'inizio della storia, non la fine; il ripristino dei trascritti di TFAM o COX1 sostiene l'idea di una richiesta di biogenesi, mentre il numero di copie del mtDNA e l'attività del complesso IV sono le prove che la richiesta è stata soddisfatta. Terzo, l'esito antiossidante non dimostra il coinvolgimento della via di Nrf2; la diminuzione del 28 percento degli ossidanti nei fibroblasti e la protezione dal rotenone nei topi sono effetti reali a valle, ma diverse vie convergono su di essi.

Cosa trasformerebbe un riquadro tratteggiato in uno continuo

Gli esperimenti mancanti sono quelli standard. Misurare la proteina Nrf2 nel nucleo dopo l'esposizione al blu di metilene, con una serie temporale coordinata al segnale transitorio di AMPK, permetterebbe di verificare se i due rami si attivino davvero insieme, come sostiene l'ipotesi dell'attivazione sincronizzata. Un reporter regolato da ARE confermerebbe l'attività trascrizionale, anziché dedurla dai geni bersaglio. Ripetere le misurazioni della biogenesi con Nrf2 silenziato o eliminato mediante knockout permetterebbe di verificare direttamente la freccia causale: se l'induzione del complesso IV e l'aumento del mtDNA persistessero senza Nrf2, il collegamento sarebbe errato e il ramo di AMPK produrrebbe da solo l'effetto. Negli animali, uno studio con somministrazione cronica e gli stessi tre punti di verifica — regolatore, contenuto, funzione — permetterebbe di verificare se il programma resti attivo o si adatti. Fino ad allora, l'attivazione sincronizzata delle vie energetiche e di difesa resta ciò che i suoi autori l'hanno definita: un possibile fattore chiave, non un meccanismo accertato.

Chi arriva dalla farmacologia più generale potrebbe voler approfondire il contesto: come il blu di metilene trasferisce elettroni a livello mitocondriale, quali altri effetti ha sui mitocondri e sull'energia cellulare, come si collocano i risultati sulla senescenza nella ricerca sull'invecchiamento, come le affermazioni sulla biogenesi si rapportano alle prestazioni cognitive e quali dati di sicurezza delimitano ogni discussione sul dosaggio. Ciascuno di questi è un concetto distinto con prove proprie, e ciascuno merita la stessa distinzione tra ciò che è misurato e ciò che è ipotizzato che questo articolo ha applicato a Nrf2.