Blu di metilene e neurotrasmettitori: serotonina, dopamina, GABA e acetilcolina

Una frase ricorrente sul blu di metilene afferma che aumenta la serotonina, aumenta la dopamina, calma il GABA e potenzia l'acetilcolina, tutto contemporaneamente. Questa frase tratta quattro risultati di laboratorio distinti come un unico effetto all'interno di una persona. Gli studi su cui si basa hanno misurato bersagli diversi, in preparazioni diverse, a concentrazioni che differiscono di un fattore di circa mille. Quando si distinguono i bersagli, il quadro diventa al tempo stesso più interessante e più cauto di quanto quella singola frase lasci intendere.

L'idea guida è semplice. Una molecola che si lega a un enzima in provetta ha fatto una sola cosa: si è legata a un enzima in provetta. Che questo modifichi il livello di un neurotrasmettitore in un cervello vivente dipende dalla concentrazione che raggiunge il tessuto, dalla forma chimica in cui si trova la molecola al suo arrivo e da tutto ciò che la molecola fa alla stessa concentrazione. Ogni sezione seguente mantiene queste tre domande associate al risultato a cui si riferiscono.

Serotonina: due bersagli, due concentrazioni

Tra i quattro sistemi, quello della serotonina dispone delle evidenze più solide, provenienti da due bersagli molecolari distinti che non vanno confusi.

Il primo bersaglio è la monoamino ossidasi di tipo A, l'enzima mitocondriale che degrada la serotonina. Il blu di metilene inibisce la MAO-A umana purificata come inibitore a legame stretto, con una Ki vicina a 27 nanomolari, mentre per influenzare la MAO-B servono concentrazioni molto più elevate, come mostrato nello studio cinetico che ha collegato il colorante alla tossicità serotoninergica. Un filone di ricerca parallelo ha riscontrato la stessa selettività nel tessuto pineale di ratto: il blocco della MAO-A aumentava gli indoli derivati dalla serotonina, riduceva il metabolita della serotonina 5-HIAA e alterava nelle rane un riflesso di raddrizzamento legato alla serotonina, come riportato nello studio sui coloranti redox e sugli indoli pineali. Due preparazioni diverse, stessa direzione: meno degradazione e più serotonina trattenuta dove l'enzima l'avrebbe rimossa.

Il secondo bersaglio è il trasportatore della serotonina stesso. In cellule che esprimevano il trasportatore umano, il blu di metilene ha ridotto la captazione sia di un substrato fluorescente sia della serotonina marcata, con una IC50 intorno a 1.4 micromolari, e ha soppresso le correnti evocate dalla serotonina nelle registrazioni patch-clamp, secondo la caratterizzazione diretta del blu di metilene sul SERT. Gli autori hanno verificato le spiegazioni alternative più evidenti e riscontrato che l'effetto era indipendente dalla segnalazione del cGMP, dalle variazioni del calcio e dall'espressione del trasportatore sulla superficie cellulare.

Si noti la distanza tra i due numeri. L'inibizione della MAO-A avviene nell'intervallo nanomolare. L'inibizione del trasportatore richiede circa cinquanta volte più colorante. Un'esposizione bassa che coinvolge pienamente l'enzima può influenzare appena il trasportatore. Chi li combina in un'unica affermazione sulla serotonina sta facendo la media di due intervalli di dose diversi.

Stabilire se uno dei due bersagli sia rilevante in una persona che assume altri farmaci serotoninergici è una questione farmacologica, da affrontare nella guida alle interazioni farmacologiche. Questo articolo traccia la mappa dei bersagli; quella pagina contiene le indicazioni cliniche.

Dopamina: le evidenze dirette più deboli

Per la dopamina, l'onestà richiede la massima cautela. Non esiste uno studio consolidato che dimostri che il blu di metilene blocca il trasportatore della dopamina o si lega direttamente ai recettori dopaminergici. La IC50 del trasportatore pari a 1.4 micromolari, citata di frequente, riguarda il trasportatore della serotonina, non il DAT, e non va mai attribuita a quest'ultimo.

Le evidenze disponibili sono invece indirette. Poiché gli enzimi MAO metabolizzano anche la dopamina, la loro inibizione preserva la dopamina insieme alla serotonina e alla noradrenalina. In preparazioni mitocondriali, il blu di metilene ha bloccato la conversione della neurotossina MPTP nel suo derivato tossico per il sistema dopaminergico, mediata dalla MAO-B, con una potenza paragonabile a quella del deprenyl, farmaco per il Parkinson, come descritto nello studio sulla bioattivazione dell'MPTP e nei lavori correlati sulla MAO-B. Gli studi sugli animali aggiungono alcuni tasselli: un aumento di circa tre volte del rilascio basale di dopamina da sezioni di striato di ratto a 10 micromolari, studiato nel contesto della segnalazione dell'ossido nitrico anziché come blocco del trasportatore, e risultati variabili tra le regioni dopo somministrazione sistemica, con alcuni studi che hanno rilevato aumenti di serotonina e noradrenalina mentre la dopamina cambiava appena.

Le evidenze sulla dopamina sono quindi reali, ma indirette. Passano attraverso un enzima che metabolizza più monoamine contemporaneamente, non attraverso un bersaglio specifico della dopamina. Qualsiasi affermazione secondo cui il blu di metilene aumenta la dopamina nelle persone salta il passaggio in cui ciò sarebbe stato effettivamente dimostrato.

GABA: bloccare il freno nella tasca di legame

Il risultato sul GABA è preciso e contrasta con la reputazione del colorante. In cellule che esprimevano recettori GABA-A umani, il blu di metilene ha inibito le correnti evocate dal GABA a partire da circa 3 micromolari, con una IC50 vicina a 31 micromolari per la comune configurazione alpha1-beta2-gamma2, nello studio elettrofisiologico che ha mappato il sito d'azione.

La parte più preziosa è la mappatura del sito. Le mutazioni nel sito della picrotossina lasciavano intatta l'inibizione, mentre i siti delle benzodiazepine e dello zinco sono stati esclusi mediante confronti tra subunità. Le mutazioni di due residui noti per formare la tasca di legame del GABA stesso riducevano invece nettamente il blocco: questo identifica l'azione come antagonismo competitivo nel sito dell'agonista, anziché come modulazione allosterica altrove. L'effetto si manteneva nelle combinazioni di subunità sinaptiche ed extrasinaptiche e scompariva rapidamente dopo il lavaggio.

Ne emerge una tensione reale che merita di essere espressa chiaramente. Una molecola studiata per il sostegno alla memoria sopprime anche la trasmissione inibitoria rapida in una preparazione in vitro. Che questa soppressione si verifichi in un cervello vivente dipende dalla concentrazione locale, e 31 micromolari è un valore elevato rispetto alla maggior parte delle esposizioni sistemiche, come affrontato nella sezione finale. La tensione stessa costituisce il risultato; per risolverla servirebbero esperimenti che nessuno ha condotto.

Acetilcolina: due bersagli con effetti opposti

Per l'acetilcolina esistono due risultati che vanno in direzioni opposte, ed è proprio per questo che devono essere riportati separatamente.

Da un lato, il blu di metilene inibisce gli enzimi che eliminano l'acetilcolina. L'acetilcolinesterasi dei globuli rossi bovini risultava inibita competitivamente intorno a 0.57 micromolari, l'enzima bovino vicino a 0.42 micromolari e l'attività esterasica del plasma umano vicino a 1.1 micromolari; la butirrilcolinesterasi risultava inibita nell'intervallo di circa 0.4–5.3 micromolari, a seconda della specie e della preparazione, come riassunto nella rassegna sulle azioni del blu di metilene nel sistema nervoso. Rallentare l'eliminazione lascia più neurotrasmettitore nella sinapsi: è lo stesso principio alla base di diversi farmaci approvati per l'Alzheimer.

Ma sul piano chimico c'è una condizione. La forma blu ossidata inibisce l'enzima; la forma ridotta incolore no, e le incubazioni lunghe che consentono al colorante di ridursi mostrano un'inibizione più debole anche solo per questo motivo. Qualsiasi valore ottenuto in un saggio sulla colinesterasi porta con sé una variabile invisibile: quanto colorante fosse ancora blu al momento della misurazione.

Dall'altro lato, il blu di metilene blocca il recettore nicotinico alpha7, uno dei recettori su cui agisce l'acetilcolina. I recettori alpha7 umani espressi in ovociti di rana risultavano inibiti con una IC50 vicina a 3.4 micromolari attraverso un antagonismo non competitivo e indipendente dal voltaggio, che lasciava invariata la potenza dell'agonista; inoltre, 3 micromolari abolivano le risposte sinaptiche indotte dalla colina in sezioni di ippocampo di ratto, come riporta lo studio sul recettore alpha7. Quindi, a concentrazioni simili nel basso intervallo micromolare, il colorante preserva il neurotrasmettitore e attenua al tempo stesso uno dei suoi recettori. L'effetto netto sulla segnalazione colinergica non si può dedurre da nessuno dei due risultati preso singolarmente. Questa ambiguità si collega alla più ampia letteratura sull'Alzheimer e alla relativa discussione della ricerca sulla cognizione e sulle malattie, senza trovare qui una soluzione.

Il confronto, in un unico quadro

Tre ordini di grandezza separano il bersaglio più sensibile da quello meno sensibile. Questa differenza riassume l'articolo in una tabella.

Queste concentrazioni raggiungono il cervello?

Un valore misurato in provetta non significa nulla senza un valore di esposizione accanto. Dopo un bolo endovenoso vicino a 1.4 mg per kg, sono stati riportati livelli plasmatici medi nell'uomo intorno a 5 micromolari, mentre una dose orale di 100 mg ha prodotto livelli nel sangue intero vicini a 0.08 micromolari nello stesso filone di letteratura. Gli studi sulla distribuzione nel ratto riscontrano livelli cerebrali circa dieci–venti volte superiori a quelli circolanti, ma si tratta del colorante totale nel tessuto omogeneizzato, non del colorante ossidato libero in una sinapsi; inoltre, il legame alle proteine plasmatiche vicino al 94 percento e la ripartizione nelle cellule del sangue riducono ulteriormente la frazione libera.

Letto alla luce della tabella, il quadro è graduale, non binario. L'inibizione della MAO-A si colloca molto al di sotto delle esposizioni endovenose tipiche ed è farmacologicamente plausibile quando il colorante viene somministrato per questa via. Gli effetti sulla colinesterasi e su alpha7 si collocano nel basso intervallo micromolare, raggiunto dai picchi endovenosi ma forse non dalle comuni dosi orali. La IC50 del GABA-A di 31 micromolari si colloca al di sopra della maggior parte delle esposizioni sistemiche plausibili, rendendo questo specifico blocco il più difficile da chiamare in causa nell'organismo nel suo complesso. Ogni riga di questo confronto richiede la stessa precisazione: la concentrazione rilevante è quella del colorante libero, ossidato ed extracellulare presso il bersaglio, una quantità che nessun prelievo di sangue misura direttamente.

Quali conclusioni non trarre

Nessuna riga della tabella dimostra che il blu di metilene aumenti o riduca in modo prevedibile un qualsiasi neurotrasmettitore in una persona. L'inibizione enzimatica in una preparazione purificata, il blocco di un trasportatore in una linea cellulare e l'antagonismo recettoriale in una sezione di tessuto sono ciascuno un passaggio controllato distante dalla realtà sinaptica; la sezione colinergica mostra inoltre due risultati veri che, contrastandosi, lasciano incertezza. L'uso responsabile di questa pagina è quello di una mappa dei bersagli ai quali è stato dimostrato che la molecola si lega, con la forza dell'interazione indicata, affinché la discussione dei meccanismi resti ancorata a ciò che è stato effettivamente misurato. Per capire come questi bersagli interagiscono con i farmaci prescritti, la guida alle interazioni è la pagina che affronta questo tema, insieme all'ulteriore contesto fornito dalle basi di farmacologia e dall'approfondimento complementare sui meccanismi.