Il blu di metilene come indicatore di anaerobiosi e ossigeno: cosa dimostra il cambiamento di colore

Una tecnica chiude ermeticamente una giara per anaerobiosi, controlla la striscia indicatrice al blu di metilene attraverso il coperchio e vede ciò che sperava di vedere. La striscia è passata dal blu al bianco. Registra la sessione come anaerobica e prosegue. Due giorni dopo, una piastra non mostra alcuna crescita, mentre una provetta sigillata contenente brodo, all'interno della stessa giara, mostra segni di esposizione all'ossigeno. La striscia diceva la verità. Lei le aveva posto la domanda sbagliata.

La confusione è concettuale. Un indicatore di anaerobiosi al blu di metilene riguarda il redox, non la sterilità né la convalida dell'intero sistema. Una volta chiarita questa distinzione, la striscia diventa uno strumento preciso e attendibile, con un compito circoscritto.

Il principio: una coppia redox reversibile

Il blu di metilene disciolto esiste in due stati. La forma ossidata è il noto catione blu. La forma ridotta, chiamata leucometilene blu, è incolore. A pH prossimo alla neutralità, la semireazione semplificata prevede un catione blu più un protone più due elettroni, che producono una molecola leuco incolore. Il potenziale formale è vicino a più 11 millivolt rispetto all'elettrodo standard a idrogeno a pH 7: un intervallo raggiungibile da molti sistemi riducenti e nel quale l'ossigeno può invertire la reazione.

La riduzione richiede un basso potenziale redox locale. La sola rimozione dell'ossigeno non sempre basta. I primi studi sull'anaerobiosi rilevarono che il blu di metilene in semplice acqua priva di ossigeno manteneva il proprio colore in assenza di una sostanza riducente e che miscele di brodo al destrosio con circa lo 0.01 percento di colorante si decoloravano facilmente a 37 C, mentre la stessa miscela mantenuta a 4 C restava blu per un giorno, come riportato negli esperimenti su tessuti freschi e condizioni di coltura anaerobica. Temperatura, pH, glucosio, ascorbato, tioglicolato e attività riducente microbica determinano tutti la disponibilità degli elettroni.

Per la riossidazione basta l'ossigeno. Quando l'aria raggiunge la forma leuco, questa torna blu. I moderni indicatori progettati appositamente sfruttano proprio questo ciclo: colorante più riducente più matrice stabilizzante, incolore a basso tenore di ossigeno e nuovamente blu dopo l'esposizione all'aria, come dimostrato da un indicatore ibrido di ossigeno al blu di metilene basato su colorante, riducente, tensioattivo e argilla. Quel prototipo utilizzava colorante a 0.01 millimolare con ascorbato o glucosio a 2.0 millimolare a pH 11, diventava incolore intorno allo 0.5 percento di ossigeno in volume e distingueva concentrazioni inferiori allo 0.1 percento da concentrazioni superiori allo 0.5 percento di ossigeno nella camera di prova.

Il principio operativo è quindi semplice. Il blu indica che la zona dell'indicatore è ossidata. L'assenza di colore indica che la zona dell'indicatore ha raggiunto condizioni riducenti e a basso tenore di ossigeno. Il cambiamento è reversibile, locale e chimico. Di per sé, non dice nulla sui microrganismi.

Come funziona una striscia indicatrice al blu di metilene in una giara per anaerobiosi

Una striscia indicatrice al blu di metilene per una giara per anaerobiosi è una piccola zona di reazione collocata nell'atmosfera della giara, dove può essere osservata senza aprire il recipiente. I formati commerciali variano: strisce di carta, compresse sciolte o bagnate durante la preparazione e carte ibride più recenti. Alcuni richiedono una goccia di acqua distillata per attivare la zona di reazione. Altri sono dispositivi in formato secco che devono rimanere asciutti. Fanno fede le istruzioni del prodotto specifico, perché idratazione, posizionamento e tempo di lettura fanno parte della chimica.

In pratica, la lettura prevista è binaria. Il blu indica che in corrispondenza della striscia persistono ossigeno o condizioni non sufficientemente riducenti. Il bianco o l'assenza di colore indicano che in corrispondenza della striscia si sono instaurate condizioni redox anaerobiche. Alcune carte commerciali aggiungono un pigmento rosso di fondo, quindi il loro stato finale ridotto appare rosa anziché bianco. Prima di valutarlo, occorre sapere quale stato finale prevede il prodotto.

I tempi variano a seconda del sistema. In un allestimento di tipo GasPak, lo sbiadimento iniziava entro circa un'ora e si completava entro poche ore, mentre in un confronto controllato a temperatura ambiente il blu di metilene richiedeva più di sei ore. In quello studio, il potenziale redox dei terreni raggiungeva circa meno 100 millivolt entro 60–100 minuti, molto prima che il colorante completasse il cambiamento, ed era ben al di sotto di meno 200 millivolt quando la striscia diventava completamente incolore. L'indicatore risponde con ritardo rispetto all'atmosfera. Una striscia blu alla prima ora non dimostra un fallimento, e una striscia bianca alla sesta ora descrive lo stato della striscia alla sesta ora.

Il posizionamento conta per lo stesso motivo. La striscia va tenuta nello spazio di testa, visibile attraverso il coperchio, lontano dalle superfici di agar e dai terreni di coltura. Segnala le condizioni del proprio ambiente immediato. Se viene appoggiata contro una parete fredda, nascosta sotto le piastre o impregnata di condensa, segnala quel microambiente anziché quello della giara.

Cosa rivela la striscia e cosa non rivela

Considerate l'indicatore al blu di metilene della giara per anaerobiosi come un singolo sensore in una singola posizione. Accerta le condizioni locali di redox e ossigeno nella propria zona di reazione, ampiamente rappresentative dello spazio di testa se miscelazione ed equilibrio sono adeguati. Tutto ciò che va oltre è una deduzione, e le deduzioni richiedono riscontri separati.

Una striscia incolore non dimostra la sterilità. La sterilità è l'assenza di organismi vitali, dimostrata mediante sterilizzazione convalidata e controlli di convalida delle colture. Una giara può essere completamente anaerobica e comunque contaminata, oppure completamente sterile e comunque aerobica.

Non convalida ogni parte del sistema di coltura. L'ossigeno disciolto in una provetta sigillata, quello intrappolato nell'agar in profondità, i gradienti in una giara affollata e una perdita che si apre dopo la lettura sfuggono tutti a una singola striscia. Esperimenti sulla distribuzione spaziale hanno mostrato zone blu e incolori adiacenti nello stesso recipiente, dove la penetrazione dell'ossigeno e l'attività riducente si bilanciavano in modo diverso. Un punto non può certificare un volume.

Non dimostra un'anaerobiosi ininterrotta. Una striscia letta una sola volta durante la preparazione non dice nulla sulla ventesima ora. Studi recenti sulla qualità delle condizioni anaerobiche avvertono che gli indicatori chimici descrivono l'atmosfera nel momento in cui vengono letti e possono apparire soddisfacenti nonostante una piccola quantità residua di ossigeno. È la documentazione continua o a intervalli prestabiliti, non una sola occhiata allo stato finale, a collegare la striscia all'incubazione.

Per approfondire la chimica alla base del cambiamento di colore, vedere come il blu di metilene passa ciclicamente tra lo stato ossidato e quello ridotto. Per capire più in generale come l'ossigeno influisce sulla gestione dei campioni, vedere il controllo dell'ossigeno nelle attività di microscopia e coltura.

Un diagramma da tenere accanto alla giara

La figura seguente riassume l'articolo in un riferimento da banco. Tre stati della stessa striscia, le due direzioni della reazione e il confine tra le evidenze fornite dall'indicatore e la convalida del sistema.

Problemi che mantengono la striscia blu o rassicurano erroneamente

La maggior parte dei problemi rientra in cinque gruppi. Ciascuno presenta un segnale caratteristico.

Una giara o una busta non a tenuta continua a far arrivare ossigeno alla zona di reazione. La striscia resta blu o torna blu dopo essere sbiadita. Controllare coperchio, guarnizione, morsetti e superfici di tenuta prima di attribuire la colpa alla chimica.

Un generatore di gas esaurito o attivato in modo errato non rimuove l'ossigeno. Nei sistemi tradizionali attivati con acqua, l'assenza di condensa intorno ai 10–15 minuti e il mancato riscaldamento del coperchio intorno ai 20–40 minuti erano segnali di allarme precoci per quel sistema. Una bustina sottodimensionata in una giara sovraccarica fallisce allo stesso modo.

L'avvelenamento del catalizzatore riguarda solo i sistemi tradizionali con idrogeno e palladio, nei quali il palladio favorisce la combinazione di idrogeno e ossigeno per formare acqua. Umidità e solfuro di idrogeno lo degradano. Molte bustine attuali non usano affatto palladio, quindi questa soluzione non va applicata dove non è pertinente.

Una striscia degradata o gestita in modo errato può non funzionare senza segnali evidenti. Colorante e riducente perdono reversibilità durante la conservazione, uno dei motivi per cui sono state sviluppate formulazioni ibride resistenti allo sbiadimento dovuto alla luce e alla perdita di funzionalità durante la conservazione. Scartare le scorte scadute, quelle con un colore iniziale anomalo e le strisce bagnate quando dovrebbero essere asciutte o lasciate asciutte quando richiedono di essere bagnate.

Un gradiente o un ritardo inganna chi legge, non la chimica. Uno spazio di testa poco miscelato, provette sigillate con ossigeno disciolto e terreni semisolidi mantengono ciascuno le proprie condizioni più a lungo di quanto suggerisca la striscia. Le strisce alla resazurina passano attraverso il rosa prima di diventare incolori e sono spesso commercializzate come più rapide, ma le loro soglie dipendono dalla specifica formulazione e non sono trasferibili al blu di metilene.

Controlli e un protocollo di lettura da adottare

Due controlli economici individuano la maggior parte degli errori di lettura. Tenere una striscia di controllo nuova nell'aria ambiente, accanto al sistema in uso. Una striscia al blu di metilene funzionante rimane blu in quelle condizioni. Alcuni indicatori confezionati sono inizialmente pallidi e diventano blu all'apertura, il che costituisce già una verifica funzionale. Inoltre, collocare periodicamente una striscia nuova in un sistema anaerobico precedentemente convalidato. Dovrebbe raggiungere lo stato finale ridotto convalidato entro il tempo specificato per il prodotto. Se uno dei due controlli si comporta in modo anomalo, sostituire il lotto prima di fidarsi delle letture nella giara.

Il protocollo di lettura deriva dal meccanismo. Collocare la striscia nello spazio di testa, in una posizione visibile senza aprire la giara, seguendo le istruzioni del prodotto per il contatto con le pareti e la bagnatura. Registrare il colore iniziale, l'ora in cui la giara è stata sigillata e il colore al momento di controllo specificato per il prodotto. Se il recipiente lo consente, registrare che l'indicatore è rimasto ridotto ai controlli prestabiliti durante l'incubazione. Registrare il colore finale immediatamente prima dell'apertura. Quel colore precedente all'apertura è il dato finale della sessione. Dopo l'apertura, è previsto che la striscia torni blu: ciò non deve modificare retroattivamente la valutazione.

Se la striscia resta blu oltre il tempo specificato, considerare l'anaerobiosi non verificata. Controllare la sequenza nell'ordine: tenuta, bustina, catalizzatore se presente, idratazione e scadenza dell'indicatore, quindi funzionamento dell'indicatore rispetto al controllo in aria. Solo dopo aver verificato l'atmosfera si dovrebbero interpretare la crescita o l'assenza di crescita, usando un allestimento di coltura anaerobica e controlli degli organismi adeguati all'applicazione.

La striscia merita l'ultima parola nel proprio ambito. Blu o incolore, risponde a una domanda su un luogo in un momento preciso. Ponetele quella domanda nei tempi previsti, con i controlli accanto, e risponderà in modo affidabile. Chiedetele della sterilità, di ogni provetta o dell'intera incubazione sulla base di una sola occhiata, e nessuna chimica dell'indicatore potrà salvare l'interpretazione.