Blu di metilene ed esposizione alla luce: lunghezza d'onda, irradianza e geometria del trattamento

Due articoli scientifici riportano l'esposizione del blu di metilene a 10 J per cm quadrato di luce. In uno vengono uccisi i batteri. Nell'altro non accade nulla di misurabile. Un lettore che confronti soltanto la dose conclude che il settore produce risultati incoerenti. Il settore è coerente. La dose non ha mai descritto l'intera esposizione.

Un'esposizione luminosa è un piccolo sistema di parametri che agiscono insieme: lunghezza d'onda, irradianza, durata, fluenza risultante, disponibilità di ossigeno, concentrazione e stato di aggregazione del colorante, intervallo tra colorante e luce e cammino ottico effettivamente percorso dalla luce nel campione. Basta modificarne uno perché cambi la fotochimica. Questo articolo esamina ogni parametro, poi distingue la fotobiomodulazione nel vicino infrarosso dalla fotoattivazione diretta del colorante, perché questi due regimi sono quelli più spesso confusi.

La lunghezza d'onda determina se il colorante partecipa

Il blu di metilene in acqua assorbe fortemente la luce rossa come monomero, con un picco intorno a 664–665 nm e una spalla a lunghezza d'onda più corta, intorno a 610 nm, che cresce quando il colorante si aggrega in dimeri e impilamenti più grandi. Il coefficiente di estinzione molare vicino al picco è dell'ordine di 65,000–85,000 M-1 cm-1, quindi le soluzioni micromolari sono già intensamente blu. La prima rassegna sulla fotochimica del blu di metilene con DNA e substrati biologici documenta questo comportamento di assorbimento e la successiva chimica dello stato eccitato: l'assorbimento popola uno stato di singoletto di breve durata, che passa a uno stato di tripletto più longevo con rese riportate intorno a 0.5; in soluzione aerata, quest'ultimo viene disattivato dall'ossigeno entro circa 2 microsecondi.

È in questo passaggio di disattivazione che i due percorsi fotochimici divergono. Nella chimica di Tipo II, il colorante nello stato di tripletto trasferisce energia all'ossigeno nello stato fondamentale e produce ossigeno singoletto, con rese comunemente citate intorno a 0.52. Nella chimica di Tipo I, il tripletto trasferisce invece un elettrone o idrogeno a un substrato, producendo radicali, tra cui specie superossido e ossidrile. Entrambi i percorsi possono procedere contemporaneamente e l'effetto fotodinamico convenzionale rimane fortemente dipendente dall'ossigeno anche quando contribuisce il Tipo I.

Per la scelta della lunghezza d'onda per il blu di metilene ne deriva una regola semplice. La luce rossa da circa 630 a 680 nm si sovrappone alla banda del colorante, con 660–665 nm vicini al massimo del monomero, quindi può attivare la chimica del fotosensibilizzante ovunque sia presente una quantità apprezzabile di colorante. Il vicino infrarosso a 810 nm si trova ben al di fuori della banda di assorbimento dello stato fondamentale, quindi è una lunghezza d'onda poco adatta all'eccitazione diretta del colorante. La concentrazione complica il quadro in un modo preciso: quando aumenta, una quota maggiore di colorante si trova in forme dimeriche e aggregate che assorbono verso 610 nm e fotosensibilizzano con minore efficienza per molecola, quindi raddoppiare il colorante non raddoppia l'effetto. La rassegna complementare sul blu di metilene e la terapia con luce rossa considera questa regola di assorbimento il presupposto di qualsiasi reazione fotosensibilizzata.

Irradianza, durata e fluenza sono tre parametri, non uno

La fluenza, espressa in J per cm quadrato, è l'irradianza moltiplicata per il tempo. Riportare soltanto la fluenza nasconde la velocità con cui è arrivata l'energia, e questa velocità conta.

Un'irradianza elevata erogata brevemente e un'irradianza bassa erogata a lungo possono produrre la stessa fluenza con una chimica diversa. Un'irradianza elevata consuma l'ossigeno disciolto più rapidamente di quanto la diffusione lo reintegri, limitando il percorso di Tipo II dipendente dall'ossigeno durante l'esposizione. Inoltre apporta calore, e il tessuto risponde al riscaldamento con variazioni del flusso sanguigno che modificano sia l'ossigenazione sia la distribuzione del colorante. Un'irradianza bassa durante un'esposizione prolungata mantiene l'apporto di ossigeno, ma lascia ai processi di riparazione e riossigenazione il tempo di agire durante l'esposizione stessa. I manuali di fotochimica chiamano reciprocità l'assunto secondo cui conta soltanto la dose totale. Questo assunto non regge ogni volta che intervengono ossigeno, riscaldamento o processi biologici, il che nei tessuti significa quasi sempre.

Le esposizioni fotodinamiche antimicrobiche nell'uomo con blu di metilene utilizzano comunemente da 6 a 18 J per cm quadrato, valori che si sovrappongono a quelli della fotobiomodulazione. La sola fluenza non può quindi identificare il regime. Un'esposizione di 10 J per cm quadrato a 660 nm su un tessuto contenente colorante è fotochimica attivata da un fotosensibilizzante. La stessa fluenza a 810 nm su un tessuto con tracce di colorante è qualcosa di completamente diverso. Il numero coincide. Il concetto è diverso.

Il cammino ottico e la geometria del campione determinano ciò che la luce incontra

Il comportamento descritto dalla legge di Beer-Lambert implica che la parte anteriore di un campione riceva molta più luce di quella posteriore. In una cuvetta con decine di micromolari di colorante, il primo millimetro può assorbire la maggior parte della luce rossa incidente, lasciando gli strati più profondi di fatto non esposti. Trasferendo la stessa soluzione in un pozzetto poco profondo e a basso volume, l'esposizione diventa quasi uniforme. Stesso colorante, stessa lampada, stessa fluenza in superficie, risultato diverso.

Il tessuto aggiunge la diffusione all'assorbimento. La luce rossa intorno a 660 nm penetra per una profondità dell'ordine dei millimetri; la profondità esatta dipende dal contenuto di sangue, dalla pigmentazione e dal tipo di tessuto. I pozzetti introducono i propri artefatti: effetto lente del menisco, riflessione dalle pareti, ombreggiamento dei pozzetti ai bordi e riscaldamento di piccoli volumi sotto la sorgente. Due laboratori che riportano impostazioni identiche della lampada ma utilizzano tipi di piastra, volumi o distanze dalla sorgente diversi hanno condotto esperimenti diversi.

La distanza merita particolare attenzione perché è la variabile non dichiarata più comune. L'irradianza diminuisce rapidamente con la distanza da una sorgente non collimata, quindi spostare una lampada da 2 cm a 5 cm sopra la piastra può ridurre l'irradianza di diverse volte, mentre la sezione dei metodi continua a descrivere le stesse condizioni. Senza una misura dell'irradianza sulla superficie del campione, le fluenze pubblicate calcolate a partire dalle potenze nominali del produttore sono stime, non misure.

Guida annotata ai parametri: cosa rende riproducibile un'esposizione

Il materiale originale di questa pagina è una lista di controllo. Qualsiasi esposizione luminosa di uno studio che ometta queste voci non può essere confrontata con un'altra, per quanto simile possa sembrare la dose riportata in sintesi.

1. Lunghezza d'onda e larghezza di banda. Picco e larghezza totale, non il nome di un colore. I LED rossi coprono l'intervallo da 630 a 680 nm, nel quale l'assorbimento del colorante varia molto.
2. Irradianza misurata sulla superficie del campione, in mW per cm quadrato. La potenza in watt dichiarata dal produttore non è l'irradianza.
3. Durata e pulsazione. Erogazione continua o pulsata, includendo la frequenza degli impulsi e il ciclo di lavoro, ove applicabili.
4. Fluenza calcolata dalla coppia di valori misurati sopra, in J per cm quadrato.
5. Concentrazione, formulazione e stato di aggregazione del colorante. Il monomero intorno a 664 nm fotosensibilizza in modo diverso dagli aggregati intorno a 610 nm.
6. Intervallo farmaco-luce. Da minuti a ore tra la somministrazione del colorante e l'irradiazione: questo intervallo determina dove si trova il colorante quando arriva la luce.
7. Ossigenazione. Una soluzione aerata rispetto a un tessuto ipossico modifica direttamente l'equilibrio tra Tipo I e Tipo II.
8. Geometria. Profondità e volume del campione, tipo di recipiente, distanza e angolo della sorgente e profondità del bersaglio nel tessuto.

Un'abitudine utile quando si leggono gli articoli scientifici: controllare prima l'intervallo farmaco-luce. Rivela l'intento. I disegni sperimentali fotodinamici irradiano deliberatamente tessuti contenenti colorante. I disegni che combinano i due interventi possono separarli intenzionalmente, come negli esempi seguenti.

La fotobiomodulazione nel vicino infrarosso non è fotoattivazione del colorante

La fotobiomodulazione, solitamente abbreviata PBM, utilizza luce rossa o nel vicino infrarosso per modulare la segnalazione endogena senza aggiungere un fotosensibilizzante. La terapia fotodinamica, solitamente abbreviata PDT, utilizza insieme tre elementi: luce assorbita dal sensibilizzante, il sensibilizzante stesso e ossigeno, per creare un picco di specie reattive che danneggia il bersaglio. Una rassegna sui mitocondri come bersaglio della neuroprotezione associa il blu di metilene alla PBM perché convergono sulla respirazione da direzioni diverse: il colorante agisce come mediatore catalitico di cicli redox, sostenendo il flusso di elettroni, mentre si ipotizza che la PBM favorisca la dissociazione dell'ossido nitrico inibitorio dalla citocromo c ossidasi nel Complesso IV. Questo meccanismo enzimatico deve rimanere indicato come ipotesi.

I due studi di combinazione sui topi più citati utilizzano entrambi luce a 810 nm, ed è proprio per questo che non dimostrano la fotoattivazione del colorante. In uno studio sul pretrattamento prima della privazione del sonno, i topi hanno ricevuto blu di metilene ogni giorno a 0.5 mg per kg, laser pulsato a 810 nm a giorni alterni oppure entrambi prima della privazione. Il pretrattamento combinato ha protetto i comportamenti legati alla memoria e le proteine sinaptiche dell'ippocampo, mentre i singoli trattamenti sono risultati in gran parte inefficaci. In uno studio sullo stress cronico con trattamento concomitante, i topi hanno ricevuto PBM a 810 nm con 8 J per cm quadrato insieme a colorante giornaliero a 0.5 mg per kg; il laser veniva applicato per primo e il colorante iniettato due ore dopo, proprio per evitare di irradiare tessuti contenenti colorante. Tutti e tre i gruppi hanno mostrato un'inversione dei deficit di apprendimento, con un beneficio additivo soprattutto per il cortisolo sierico e le specie reattive dell'ossigeno nel cervello. Questi risultati valutano due interventi mitocondriali utilizzati insieme, una distinzione che la raccolta degli studi fotodinamici mantiene evidente registrando la lunghezza d'onda per ciascuna indicazione.

Le evidenze sulla pelle si collocano sull'altro versante. I dati nell'uomo sul blu di metilene associato alla luce per la pelle si concentrano nell'intervallo da 630 a 680 nm, con colorante topico o intralesionale e finalità distruttive o di rimodellamento: si tratta quindi di PDT per definizione. Citare la risoluzione osservata come prova che il colorante potenzia la PBM, oppure citare il recupero ottenuto nei topi a 810 nm come prova che un pannello a 660 nm associato al colorante costituisca un protocollo per le funzioni cognitive, significa confondere i regimi. Il riferimento su dosaggio e farmacologia e la guida alla sicurezza e alle interazioni approfondiscono gli aspetti di questa questione relativi alla concentrazione e alle controindicazioni.

Definite il concetto prima di confrontare i numeri. La lunghezza d'onda determina se il colorante assorbe. L'irradianza e la durata determinano cosa fa la chimica con quell'assorbimento. La geometria determina quale parte del campione ne risente. Due esposizioni che coincidono per un parametro ma differiscono per gli altri sono esperimenti diversi, e considerarle intercambiabili è l'errore che questa guida intende prevenire. Da tutto questo non deriva alcun protocollo domestico: una luce con lunghezza d'onda compatibile, associata a un colorante sistemico, trasforma un'esposizione altrimenti modulante in fotochimica attivata da un fotosensibilizzante, che compete ai professionisti clinici.