Perché il blu di metilene viene usato come colorante di contrasto per l'acido-resistenza

Un tecnico esamina uno striscio di espettorato dopo l'intera sequenza di colorazione. Bastoncelli rossi risaltano su un campo blu e il referto riporta la presenza di bacilli acido-resistenti. Il giorno successivo, un altro vetrino mostra un campo uniformemente blu senza bastoncelli rossi e viene refertato come negativo per la tubercolosi. Uno di questi referti afferma più di quanto il vetrino consenta di concludere, e non è il primo.

La confusione è concettuale. Il tecnico ha considerato il colorante blu parte della chimica di rilevazione, come se il blu di metilene contribuisse a individuare i micobatteri. Non è così. Quando il blu di metilene entra in contatto con il vetrino, il test è già concluso. Il colorante colora soltanto lo sfondo per rendere leggibile il risultato. Questo articolo spiega la funzione del blu di metilene nella colorazione per l'acido-resistenza, perché si usa il blu anziché un altro colore e quali conclusioni consente di trarre il rosso sul blu.

La risposta breve

La colorazione per l'acido-resistenza è un test differenziale basato su tre principi. La fucsina fenicata, il colorante primario, viene fatta penetrare in ogni cellula, compresi i micobatteri dall'involucro ceroso. L'acido-alcol, il decolorante, rimuove il colorante rosso dalle cellule comuni, ma non riesce a estrarlo da quelle acido-resistenti. Il blu di metilene, il colorante di contrasto, colora poi tutto ciò da cui il decolorante ha rimosso il colorante primario: le cellule non acido-resistenti, le cellule dell'ospite e i detriti appaiono quindi blu, mentre i bacilli acido-resistenti restano rossi. Il colorante di contrasto fornisce contrasto. Non interviene nella chimica che rende una cellula acido-resistente.

La funzione di ogni passaggio

Il diagramma seguente mostra la divisione dei compiti. Leggilo da sinistra a destra come una procedura, e considera la fascia inferiore un promemoria del fatto che ogni famiglia di colorazioni risponde a una domanda diversa.

La penetrazione viene per prima. I micobatteri resistono ai comuni coloranti acquosi perché il loro involucro è insolitamente idrofobo, quindi il protocollo ne forza l'ingresso. Nel metodo di Ziehl-Neelsen, il riscaldamento fino allo sviluppo di vapori fa penetrare la fucsina fenicata, contenente fenolo, attraverso la parete cerosa. Nel metodo a freddo di Kinyoun, il calore viene sostituito da una formulazione molto più concentrata del colorante primario, e alcune versioni modificate senza riscaldamento aggiungono tensioattivi. I protocolli di colorazione per l'acido-resistenza dell'American Society for Microbiology documentano entrambe le formulazioni a confronto, e la differenza di concentrazione è notevole: circa 0.3 g di fucsina basica per 100 mL nel metodo a caldo contro circa 4 g nel metodo a freddo.

La differenziazione viene per seconda. L'acido-alcol, comunemente costituito da 3 mL di acido cloridrico concentrato in 97 mL di etanolo al 95 per cento, rimuove il colorante rosso da ogni cellula la cui parete non offre una resistenza particolare. Le cellule con un involucro lipidico micobatterico intatto trattengono il colorante. Questo è il passaggio su cui si basa l'intero metodo, nonché quello più sensibile alla tecnica, come discusso di seguito.

Il contrasto viene per ultimo. Il vetrino contiene ora cellule acido-resistenti rosse su uno sfondo quasi incolore di cellule decolorate. Il blu di metilene allo 0.3 per cento w/v rende nuovamente visibile quello sfondo con un colore nettamente distante dal rosso. La colorazione di contrasto è breve, tipicamente da 20 a 30 secondi nel metodo a caldo e fino a qualche minuto in alcune varianti del metodo a freddo; la durata dipende dal protocollo, non da una proprietà del colorante stesso.

Perché questo colorante, e perché il blu

Il blu di metilene è un colorante basico cationico: il suo ione colorato ha quindi una carica positiva e si lega alle superfici cariche negativamente dei batteri decolorati, delle cellule dell'ospite e dei detriti. OpenStax Microbiology descrive questa interazione tra cariche come il principio generale alla base dei coloranti basici. Tuttavia, in questo contesto il blu di metilene non ha proprietà chimiche esclusive. Anche il cristalvioletto e la safranina sono coloranti basici. La scelta è ottica, non chimica.

I bastoncelli rossi richiedono uno sfondo di tonalità contrastante, e il blu si contrappone al rosso nel modo più utile per la microscopia in campo chiaro. La safranina sarebbe un colorante di contrasto poco adatto perché il suo colore finale rosa-rosso è troppo vicino a quello della fucsina fenicata trattenuta, annullando proprio la distinzione creata dalla procedura. Il cristalvioletto produrrebbe uno sfondo viola scuro che distoglierebbe l'attenzione dai sottili bacilli rossi. La prova più forte che la funzione sia creare contrasto, anziché intervenire nella chimica, è la possibilità di sostituzione: coloranti di contrasto verdi, come il verde malachite e il verde brillante, vengono impiegati in alcuni protocolli veterinari e modificati, e il test continua a funzionare perché qualsiasi tonalità chiaramente diversa svolge lo stesso compito.

Ne derivano due conseguenze pratiche. Primo, la formulazione standard non prevede alcuna regolazione del pH; non confondere questa semplice soluzione acquosa allo 0.3 per cento con formulazioni alcaline come il blu di metilene di Loeffler, che appartengono a un diverso approccio alla colorazione. Secondo, eccedere è controproducente. La letteratura istologica avverte espressamente che uno sfondo blu troppo intenso può mascherare bacilli poco numerosi: lasciare il vetrino coperto di colorante più a lungo di quanto previsto dal protocollo compromette quindi la leggibilità senza offrire alcun vantaggio.

La chimica della parete che rende possibile il test

La ragione per cui l'acido-alcol discrimina tra le cellule risiede nell'involucro micobatterico. Il suo nucleo strutturale è il complesso micolil-arabinogalattano-peptidoglicano: peptidoglicano legato ad arabinogalattano, alle cui estremità esterne si legano acidi micolici a catena molto lunga, formando una micomembrana esterna ricca di lipidi e dalla permeabilità insolitamente bassa. La rassegna sulla membrana esterna dei micobatteri descrive in dettaglio questa architettura. La barriera agisce in entrambe le direzioni. Resiste all'ingresso del colorante, motivo per cui la penetrazione richiede calore o un colorante primario più concentrato, e resiste all'estrazione del colorante, motivo per cui l'acido-alcol non riesce a rimuovere la fucsina fenicata una volta penetrata. I batteri comuni non hanno questo involucro e perdono il colorante. L'acido-resistenza va quindi interpretata soprattutto come un fenomeno dovuto alla barriera lipidica, non come un legame chimico della fucsina con l'acido micolico.

Questa chimica spiega anche un fenomeno spesso difficile da interpretare: i micobatteri si colorano poco e in modo imprevedibile con il metodo di Gram, talvolta apparendo come forme debolmente colorate e granulari oppure come sagome non colorate. La loro parete idrofoba limita la penetrazione del cristalvioletto. La colorazione per l'acido-resistenza non è una colorazione di Gram modificata. È un diverso principio differenziale, basato su una diversa proprietà della parete, come mostra il confronto tra colorazione semplice e colorazione di Gram per gli altri due metodi.

Tre metodi, tre domande

Per la più ampia famiglia dei metodi batterici con un solo colorante, consulta l'atlante delle colorazioni per microscopia.

Cosa non può dimostrare il rosso sul blu

I bastoncelli rossi indicano che gli organismi hanno trattenuto la fucsina fenicata durante il trattamento con acido-alcol. Questo riscontro è compatibile con Mycobacterium tuberculosis, ma le indicazioni dei CDC per la diagnosi della tubercolosi precisano esplicitamente che anche altri micobatteri sono acido-resistenti: l'identificazione della specie richiede quindi coltura e test degli acidi nucleici, non il colore.

Gli errori tecnici si concentrano sui due lavaggi. Una decolorazione insufficiente lascia rosso il materiale di fondo e favorisce letture falsamente positive. Una decolorazione eccessiva rimuove il colorante primario debolmente trattenuto e contribuisce ai falsi negativi. Una colorazione di contrasto troppo intensa nasconde nel blu i bacilli poco numerosi. Strisci spessi, reagenti precipitati e acqua di risciacquo contaminata aggiungono ulteriori artefatti.

La sensibilità è limitata dalla carica microbica, per quanto corretta sia la tecnica. La microscopia convenzionale dello striscio richiede circa 5,000–10,000 bacilli per millilitro di espettorato, e precedenti rassegne delle evidenze dei CDC collocavano la sensibilità dello striscio intorno al 45–80 per cento nei casi polmonari confermati mediante coltura. Uno striscio negativo, quindi, non esclude mai la tubercolosi. Le attuali indicazioni dei CDC prevedono la coltura insieme a ogni striscio e raccomandano un test di amplificazione degli acidi nucleici su almeno un campione respiratorio quando si sospetta una tubercolosi polmonare e il risultato modificherebbe la gestione clinica.

La pratica deve seguire protocolli autorizzati

Le descrizioni didattiche, compreso questo articolo, non autorizzano lo svolgimento di attività cliniche. Per il lavoro al banco, segui la procedura operativa standard validata del laboratorio, allineata ai documenti aggiornati dei CDC, dell'APHL o del CLSI; il documento di riferimento dei CDC sulla colorazione per l'acido-resistenza conservato nell'archivio Stacks mostra come queste procedure specifichino reagenti e criteri di lettura. Il lavoro sui campioni per la tubercolosi richiede misure di contenimento: gli strisci vengono preparati in una cabina di sicurezza biologica perché la preparazione genera aerosol e schizzi, e le indicazioni dei CDC sulla sicurezza in laboratorio affermano che anche gli strisci fissati al calore possono contenere bacilli tubercolari vitali e devono comunque essere trattati come contaminati. La scheda della Public Health Image Library dei CDC su uno striscio colorato con fucsina fenicata e blu di metilene ed esaminato per M. leprae ricorda utilmente l'ambito di applicazione del metodo oltre la tubercolosi: lo stesso contrasto rosso su blu serve ovunque si cerchino organismi acido-resistenti, e anche una lettura negativa eseguita con attenzione è un risultato che merita di essere registrato.

Leggere il vetrino finito

Il colorante di contrasto dimostra la propria utilità durante l'esame preliminare. Chi esamina il vetrino al microscopio a basso ingrandimento usa prima lo sfondo blu per valutare la qualità dello striscio: distribuzione uniforme delle cellule, cellule dell'ospite integre per la messa a fuoco, assenza di precipitati abbondanti. Le strutture rosse sospette attirano poi lo sguardo proprio perché nient'altro sul vetrino è rosso. La conferma avviene con l'obiettivo a immersione in olio, con cui i veri bacilli mostrano i sottili bastoncelli attesi, talvolta leggermente curvi o granulari, anziché detriti uniformi di colorante.

La colorazione dello sfondo determina anche il linguaggio del referto. Un vetrino con bacilli rossi viene refertato come presenza di bacilli acido-resistenti, spesso con un grado semiquantitativo secondo la scala del laboratorio. Un vetrino senza organismi rossi viene refertato come assenza di bacilli acido-resistenti osservati, mai come negativo per la tubercolosi. La distinzione conta perché il campo blu dimostra che la colorazione ha funzionato, che le cellule hanno assorbito il colorante di contrasto e che le condizioni ottiche erano adeguate, senza però dire nulla sugli organismi al di sotto del limite di rilevazione. Un campo blu privo di bacilli è un risultato valido sul vetrino, non un verdetto sul paziente.

Ricorda la divisione dei compiti e i referti saranno facili da formulare. La fucsina fenicata evidenzia i possibili organismi. L'acido-alcol esegue il test. Il blu di metilene rende soltanto leggibile la risposta: il rosso ha trattenuto il colorante nonostante l'acido, il blu lo ha perso. Tutto il resto, specie, carica microbica e significato clinico, deriva da indagini che vanno oltre il vetrino.