Blu di metilene e cellule di supporto cerebrale: astrociti, microglia e infiammazione

Supponiamo di condurre due esperimenti con lo stesso colorante blu e di ottenere due risultati incoraggianti. In una piastra, cellule di supporto a forma di stella sopravvivono alla privazione di ossigeno e glucosio. In un'altra, le cellule immunitarie del cervello mantengono la loro forma ramificata e quiescente nonostante una tossina batterica. È allettante riunire i due risultati in un'unica affermazione: il colorante attenua l'infiammazione cerebrale e protegge il cervello. È proprio davanti a questa combinazione che un lettore attento dovrebbe fermarsi a riflettere.

Il cervello ha due popolazioni di supporto con compiti diversi, e il blu di metilene viene studiato in ciascuna attraverso uno stimolo sperimentale diverso. Gli astrociti sono cellule di supporto metabolico. Si trovano tra i vasi sanguigni e i neuroni, rimuovono il glutammato in eccesso, tamponano le variazioni di potassio, immagazzinano glicogeno e trasferiscono combustibile ai neuroni quando la richiesta aumenta bruscamente. Le cellule della microglia sono le sentinelle immunitarie residenti. I loro sottili prolungamenti sorvegliano il tessuto, rilevano segnali batterici e di danno e, in caso di allarme, si ritraggono assumendo una forma ameboide arrotondata, adatta alla migrazione e all'inglobamento, mentre rilasciano molecole di segnalazione. Un risultato ottenuto in una popolazione non si trasferisce all'altra, e la misurazione usata in ciascun caso determina che cosa sia stato effettivamente dimostrato.

Astrociti sotto stress metabolico: il risultato sta nelle tempistiche

L'esperimento sugli astrociti inizia con una privazione. I ricercatori hanno coltivato astrociti corticali di topi neonati, rimosso il glucosio e quasi tutto l'ossigeno per sei ore, quindi ripristinato entrambi per ventiquattro ore: un modello di laboratorio di ictus seguito da riperfusione. Quando il blu di metilene era presente durante la fase di privazione, la sopravvivenza cellulare peggiorava. Quando veniva aggiunto soltanto durante la fase di riossigenazione, a 0.1 e 1 micromolare, la sopravvivenza migliorava significativamente, secondo un saggio di vitalità con calceina. Lo studio sugli astrociti murini riporta questa differenza legata alle tempistiche insieme ai dati sulla respirazione.

Questa differenza è il risultato più importante. Durante la privazione non c'è quasi ossigeno disponibile per accettare elettroni, quindi un trasportatore di elettroni non ha dove consegnarli. Durante la riossigenazione il sistema riparte e il colorante può svolgere il proprio ruolo. Gli astrociti trattati consumavano più ossigeno, assorbivano più glucosio, producevano più ATP e ricostituivano le riserve di glicogeno, con una maggiore attività dell'esochinasi e senza aumento del superossido mitocondriale. La spiegazione proposta è quella già descritta nella trattazione del blu di metilene come trasportatore mitocondriale di elettroni: trasferire gli elettroni oltre i punti bloccati della catena respiratoria, così che la respirazione riparta correttamente anziché disperdere elettroni generando specie reattive.

È importante notare di quale tipo di evidenza si tratti. È un risultato relativo alla sopravvivenza e al metabolismo in un singolo tipo cellulare isolato, con una finestra efficace specificata (recupero, non privazione) e un intervallo di concentrazioni definito. Non dice nulla sulla segnalazione immunitaria, né sul comportamento.

Microglia in stato di allarme batterico: riprogrammazione del metabolismo

Gli esperimenti sulla microglia partono dallo stimolo opposto: non una carenza di nutrienti, ma una falsa infezione. Il lipopolisaccaride, un frammento della membrana esterna batterica, si lega ai sensori dell'immunità innata e induce la microglia a rilevare l'arrivo di patogeni, anche se non sono presenti batteri vivi. Nei topi a cui viene somministrato lipopolisaccaride e in una linea cellulare microgliale in coltura, il risultato è un noto programma infiammatorio: aumentano i fattori proinfiammatori, la microglia si polarizza verso lo stato aggressivo M1, i neuroni vicini muoiono e gli animali ottengono risultati peggiori nei compiti di apprendimento e memoria.

Lo studio murino su questa risposta la riconduce a una via di rilevamento dell'ossigeno: il lipopolisaccaride induce la sovraespressione di PHD3, uno dei tre enzimi prolil-idrossilasi, attraverso una catena Siah2/Morg1 a monte. Allo stesso tempo, le cellule riprogrammano il proprio utilizzo dell'energia verso la glicolisi aerobica, con un aumento delle specie reattive dell'ossigeno mitocondriali: un cambiamento che gli autori hanno misurato direttamente con saggi metabolici Seahorse del consumo di ossigeno e dell'acidificazione extracellulare. Il blu di metilene ha invertito sia il cambiamento metabolico sia la sovraespressione di PHD3, abbassato i fattori infiammatori, ridotto la morte neuronale e migliorato i punteggi nei test comportamentali. La tomografia a emissione di positroni ha aggiunto dati di imaging: il lipopolisaccaride aumentava la captazione di glucosio nell'ippocampo alla FDG-PET, e il trattamento la riduceva nuovamente, in linea con un metabolismo infiammatorio meno attivo nel cervello vivente.

Si tratta di un insieme di misurazioni più ricco rispetto allo studio sugli astrociti (citochine, metabolismo, imaging, comportamento negli animali), ma riguarda uno stimolo diverso e una cellula diversa. Chi confronta i due studi dovrebbe tenere distinti gli stimoli: uno studio preserva durante il recupero cellule di supporto private di nutrienti, l'altro attenua un falso allarme di infezione nelle cellule immunitarie.

Microglia al microscopio: la forma come parametro misurato

Un terzo esperimento esamina lo stesso allarme batterico considerando soltanto la forma. Nelle colture gliali ottenute dalla corteccia di ratto, le cellule microgliali di controllo colorate per il marcatore IBA1 mostrano numerosi prolungamenti sottili, la forma ramificata tipica della sorveglianza. Dopo ventiquattro ore di esposizione al lipopolisaccaride a 10 microgrammi per millilitro, le cellule si appiattiscono assumendo la forma ameboide, e l'area del corpo cellulare aumenta mentre il perimetro rimane pressoché costante: la caratteristica geometrica dell'arrotondamento. Il blu di metilene a 1 micromolare, somministrato insieme alla tossina, ha preservato i prolungamenti ramificati e mantenuto l'area del corpo cellulare e il perimetro vicini ai valori di controllo. Lo studio sulle colture di ratto quantifica questa preservazione della forma misurando l'area del corpo cellulare e il perimetro.

Due dettagli rendono questo studio più significativo di una semplice immagine. Innanzitutto, il composto di confronto, il menadione, un'altra molecola attiva nelle reazioni redox alla stessa concentrazione, non ha preservato la forma e, da solo, ha spinto le cellule verso la forma attivata: l'effetto, quindi, non è una proprietà generica di tutte le molecole che partecipano a cicli redox. In secondo luogo, gli autori collegano l'effetto del colorante all'attivazione di Nrf2, un fattore di trascrizione che regola il programma dei geni antiossidanti e antinfiammatori, anziché alla sola neutralizzazione diretta delle specie reattive. Gli approfondimenti correlati sulla segnalazione redox e infiammatoria contestualizzano questo legame con Nrf2.

La forma resta comunque il parametro meno informativo dei tre. Una cellula ramificata è solitamente una cellula in sorveglianza e una cellula arrotondata è solitamente attivata, ma la morfologia è un indicatore indiretto, non una trascrizione di ciò che accade. Questa coltura non conteneva cellule immunitarie provenienti dal sangue, né circuiti neurali, né permetteva di osservare esiti comportamentali.

Leggere i tre risultati uno accanto all'altro

Il quadro che emerge dalle righe è che ogni stimolo ha la propria misurazione e la propria risposta. Il recupero metabolico risponde a una domanda sul metabolismo. I dati sulle citochine e sul comportamento rispondono a una domanda sull'infiammazione. La forma risponde a una domanda sulla forma. Nessuno dei tre risultati, da solo, si estende agli altri ambiti.

Che cosa non dimostra una microglia dall'aspetto più quiescente

Questa è la frase fondamentale per l'intero argomento: una microglia dall'aspetto meno attivato, o un metabolismo microgliale alterato, non dimostra di per sé un miglioramento della funzione cerebrale.

La morfologia può cambiare senza che la funzione cambi di conseguenza. Una cellula può mantenere le proprie ramificazioni pur continuando a rilasciare citochine, oppure arrotondarsi mentre svolge un'utile rimozione dei detriti. Le misurazioni metaboliche hanno lo stesso limite: un tracciato Seahorse o una scansione PET mostra la gestione dell'energia, non le capacità cognitive. Lo studio sui topi che ha affiancato misurazioni metaboliche e parametri di tipo morfologico a test comportamentali è più solido proprio perché ha integrato più livelli di evidenza, anziché affidare la conclusione a una sola misurazione. Anche in quel caso valgono i consueti limiti, perché il lipopolisaccaride modella un allarme sterile anziché un'infezione reale, i topi non sono persone e gli autori stessi segnalano differenze tra specie. Chiunque pianifichi studi successivi dovrebbe valutare come i risultati sulla microglia si trasferiscano tra modelli prima di presumere che la via si comporti in modo identico nel tessuto umano.

Ne deriva una conseguenza pratica per le tempistiche. Il risultato sugli astrociti mostra effetti sfavorevoli della somministrazione precoce e favorevoli della somministrazione durante il recupero. I risultati sulla microglia derivano dalla somministrazione in prossimità dello stimolo infiammatorio. Nella realtà, una lesione cerebrale combina entrambe le fasi contemporaneamente: deficit energetico e allarme immunitario, che evolvono nell'arco di ore. Un esperimento che isola una fase non può stabilire le tempistiche per il caso combinato; per questo le discussioni sulle finestre di somministrazione mantengono separate le sequenze temporali della privazione e dell'infiammazione.

Una sintesi onesta sta in un paragrafo. Negli astrociti isolati, il blu di metilene somministrato durante la riossigenazione riavvia la respirazione e salva le cellule. Nella microglia esposta a un frammento batterico, inverte un programma metabolico infiammatorio attraverso una specifica via PHD3 e preserva la forma a riposo. Ogni risultato è reale nel proprio contesto sperimentale, e nessuno dei due costituisce un verdetto generale sull'infiammazione cerebrale. Il confronto tra le cellule gliali è utile proprio perché impedisce alle due storie di confondersi in una sola.