Le colorazioni con blu di metilene alcalino di Loeffler e policromo spiegate

Su un banco per colorazioni possono trovarsi tre flaconi affiancati, ciascuno etichettato con una variante del blu di metilene. Uno riporta blu di metilene in soluzione acquosa all'1%. Un altro riporta blu di metilene alcalino di Loeffler. Un altro ancora riporta blu di metilene policromo. Un operatore indaffarato prende quello più vicino. Lo striscio si colora poi troppo debolmente, oppure di un blu troppo uniforme, oppure assume tonalità viola inattese, e la colpa viene attribuita al campione.

È un problema di formulazione, non del campione. Le tre soluzioni contengono coloranti correlati, ma si basano su principi di colorazione diversi. Una è un semplice colorante cationico a pH quasi neutro. Una è lo stesso colorante reso più incisivo dall'alcali. Una non è più nemmeno un singolo colorante, ma una miscela ossidata deliberatamente. Basta usare quella sbagliata perché il principio di colorazione cambi sotto le proprie mani.

La risposta in breve

Il blu di metilene in semplice soluzione acquosa è il riferimento di base: circa l'1% di colorante in acqua, un semplice colorante cationico per la morfologia batterica e la microscopia generale. Il blu di metilene alcalino di Loeffler aggiunge una piccola quantità misurata di alcali diluito a una soluzione madre alcolica diluita in acqua: questo aumenta il pH e favorisce un legame più marcato del colorante cationico alle strutture batteriche acide. Il blu di metilene policromo è blu di metilene sottoposto deliberatamente a maturazione mediante ossidazione in ambiente alcalino; il flacone contiene quindi una miscela di omologhi demetilati (azure A, azure B, azure C), tionina e violetto di metilene, insieme a blu di metilene residuo, e questa miscela colora strutture diverse con tonalità diverse.

Se devi ricordare una sola frase: l'alcalinizzazione modifica l'intensità della colorazione, mentre la policromizzazione ne modifica i colori.

Blu di metilene in comune soluzione acquosa: il punto di riferimento

La formulazione più semplice è il blu di metilene disciolto in acqua, comunemente all'1% w/v, senza alcali e senza ossidazione. La specie colorata è il catione metiltioninio con un controione cloruro, un piccolo colorante fenotiazinico planare descritto nella scheda del blu di metilene su PubChem come cloruro di metiltioninio. Essendo un catione, si lega allo scheletro fosfato degli acidi nucleici e ai gruppi acidi delle pareti cellulari batteriche, colorando le cellule di blu su uno sfondo chiaro.

Il suo pregio è la prevedibilità. Nuclei e batteri appaiono blu. Il contrasto è modesto. Gli organismi poco evidenti possono colorarsi debolmente, ed è proprio questo il limite che Loeffler si propose di superare. Per la famiglia più ampia delle colorazioni batteriche semplici a cui appartiene questa soluzione, consulta una panoramica sulla colorazione batterica semplice. Anche qui è importante identificare correttamente il colorante: il blu metile è una molecola completamente diversa, come spiega il confronto tra blu metile e blu di metilene, quindi una ricerca in catalogo basata soltanto sul nome del colore può portare alla classe di coloranti sbagliata.

Blu di metilene alcalino di Loeffler: lo stesso colorante, con un'azione più intensa

La ricetta classica di Loeffler combina una soluzione madre alcolica di blu di metilene con un alcali diluito in acqua. Le versioni riportate nei manuali prevedono 0.3 g di colorante in 30 mL di etanolo al 95% più 100 mL di idrossido di potassio in soluzione acquosa allo 0.01% (oppure, in modo equivalente, 30 mL di blu di metilene in soluzione alcolica satura, 100 mL di acqua distillata e 1 mL di KOH all'1%), ottenendo una soluzione di lavoro con circa lo 0.3% di colorante a pH nettamente alcalino. Le versioni commerciali seguono lo stesso principio, e il catalogo dei coloranti per microbiologia di Thermo Fisher elenca il blu di metilene alcalino di Loeffler accanto alle varianti policroma e acquosa come articoli di catalogo distinti, con impieghi previsti differenti.

L'alcali è l'elemento determinante. L'aumento del pH deprotona i gruppi carbossilici e fosfato del campione, aumentando la densità dei siti negativi, mentre la soluzione madre in etanolo mantiene il colorante completamente disciolto, così che raggiunga quei siti in forma monomerica. Il risultato è una colorazione dei batteri più rapida e intensa rispetto a quella ottenuta con il colorante acquoso neutro, con i caratteristici bacilli e cocchi blu intenso di uno striscio batteriologico di routine. Il tempo di colorazione è generalmente da uno a tre minuti, seguito da un risciacquo con acqua.

L'applicazione classica riguarda Corynebacterium diphtheriae coltivato su terreno al siero di Loeffler: bacilli sottili, spesso claviformi, con granuli metacromatici di Babes-Ernst costituiti da polifosfato di riserva e fortemente colorati. L'abbinamento tra terreno e colorante è storico, entrambi attribuiti allo stesso batteriologo, e il contrasto dei granuli ne costituisce il vantaggio diagnostico. Al di fuori del lavoro sulla difterite, il colorante viene usato come colorante batteriologico generale per strisci da colture, per osservare la morfologia di Neisseria negli strisci clinici e ovunque una colorazione di Gram non sia necessaria ma il semplice blu acquoso risulti troppo tenue. È un colorante monocromatico. Tutto ciò che è acido assume una qualche tonalità di blu. Quando un protocollo richiede una differenziazione cromatica, l'alcali da solo non può fornirla.

Una precauzione pratica: le soluzioni alcaline di colorante si deteriorano e precipitano durante la conservazione e con l'assorbimento di anidride carbonica. I laboratori preparano quindi volumi contenuti oppure acquistano la soluzione a catalogo e ne rispettano la durata di conservazione, invece di continuare a utilizzare un vecchio flacone che ormai deposita sedimenti su ogni vetrino.

Blu di metilene policromo: un nome, più coloranti

Il blu di metilene policromo parte dallo stesso colorante, ma lo sottopone a un'ossidazione controllata in ambiente alcalino, storicamente chiamata maturazione o policromizzazione. L'invecchiamento in ambiente alcalino, il riscaldamento con carbonato o l'ossidazione con agenti come il dicromato rimuovono gradualmente i gruppi metilici dai sostituenti dimetilamminici. Il prodotto è una miscela: blu di metilene residuo più azure B (perdita di un metile), azure A e azure C (ulteriore demetilazione), tionina (completamente demetilata) e prodotti secondari di ossidazione della famiglia del violetto di metilene. Ogni componente ha una propria tonalità e affinità per i tessuti, perciò la miscela colora in modo metacromatico: nuclei, granuli, mucine e cartilagine assumono ciascuno tonalità distinte, dal blu al rosso-viola.

Questa chimica è la stessa alla base delle celebri colorazioni ematologiche. I primi ricercatori scoprirono che il blu di metilene alcalinizzato colorava i nuclei dei parassiti della malaria con tonalità viola, ma le loro soluzioni acquose maturate erano instabili e precipitavano nel giro di pochi giorni. La rassegna su come fu inventata la colorazione viola del sangue ripercorre come Malachowski e Romanowsky sfruttarono indipendentemente questo effetto nel 1891, come il metanolo fu introdotto per stabilizzare il precipitato del colorante e fissare gli strisci senza calore, e come Giemsa standardizzò in seguito la miscela usando quantità misurate di azure B ed eosina, con stabilizzazione mediante glicerolo. Le moderne colorazioni di tipo Giemsa derivano direttamente dal blu di metilene policromo associato all'eosina, la combinazione che produce l'effetto Romanowsky. Per approfondire l'abbinamento con l'eosina e il componente azure B, consulta le colorazioni di tipo Romanowsky e l'interazione tra azure B ed eosina.

Poiché è una miscela, il blu di metilene policromo è per sua natura il meno standardizzato dei tre. Il suo preciso equilibrio cromatico dipende dal metodo e dal grado di ossidazione: per questo i fornitori di prodotti per istologia lo vendono come prodotto distinto, con proprie prove di prestazione, anziché come soluzione di Loeffler invecchiata. Gli impieghi tipici comprendono l'evidenziazione metacromatica dei granuli dei mastociti, delle mucine e della cartilagine, l'osservazione dei dettagli delle plasmacellule e di Helicobacter pylori nelle sezioni tissutali mediante metodi policromi di tipo Goodpasture. È la scelta giusta quando l'obiettivo è differenziare mediante il colore, e quella sbagliata quando il protocollo richiede un profilo batterico netto e monocromatico.

Confronto tra formulazioni e scopi

Leggi la tabella come una guida alla scelta. Se il campione si colora troppo debolmente, cambia l'approccio al pH e scegli la soluzione di Loeffler. Se tutto si colora ma nulla si distingue, cambia l'approccio al colorante e scegli il policromo. Se uno striscio colorato con Loeffler mostra magnificamente i granuli ma il responsabile chiede perché nuclei e citoplasma abbiano lo stesso blu, la risposta è che nessun colorante alcalino monocromatico può svolgere quel compito. Quella richiesta riguarda la famiglia dei policromi e i suoi derivati per le colorazioni ematologiche.

Evitare le confusioni più comuni

Due errori spiegano gran parte della confusione. Il primo consiste nel considerare la soluzione di Loeffler intercambiabile con il semplice blu di metilene perché entrambi appaiono blu nel flacone. Differiscono per pH e intensità, e sostituire il colorante neutro quando è specificata la soluzione di Loeffler fa perdere proprio il contrasto dei granuli su cui si basa il protocollo. Il secondo consiste nel considerare policromo qualsiasi blu alcalino vecchio o invecchiato accidentalmente. L'invecchiamento incontrollato produce una miscela sconosciuta a concentrazione sconosciuta, mentre le vere soluzioni policrome vengono preparate mediante processi di ossidazione definiti e, nella linea delle colorazioni ematologiche, combinate con quantità misurate di eosina. La storia è istruttiva: le instabili soluzioni acquose maturate degli anni 1890 furono sostituite da formulazioni metanoliche stabilizzate proprio perché le miscele incontrollate non erano riproducibili, una lezione da ricordare prima di colorare un vetrino diagnostico usando un flacone di età incerta.

L'attenzione ai nomi chiude il cerchio. Verifica sull'etichetta l'articolo di catalogo (acquoso, Loeffler o policromo), il contenuto di colorante e l'applicazione prevista, anziché dedurli dal colore. Le tre formulazioni condividono un cromoforo di origine comune. Non condividono lo stesso scopo.