Litun með metýlenbláu: smásjáraðferðir og safn raunverulegra smásjármynda

Litun með metýlenbláu auðveldar að greina frumueinkenni sem annars sjást illa við ljóssviðssmásjárskoðun. Hún getur hjálpað nemendum að finna kjarna í frumu úr kinn eða skoða útlínur og uppröðun örvera. Blár hlutur er þó aðeins athugun. Að greina hvaða lífvera þetta er, mæla hana og meta hvort hún bendi til sjúkdóms eru aðskilin verkefni.

Forsíðumyndin sýnir meginregluna um birtuskil. Myndasafnið hér að neðan inniheldur raunverulegar ljósmyndir af sýnum sem hafa verið skráð hvert fyrir sig, ásamt upprunalegum heimildaupplýsingum.

Hvað sýnir metýlenblátt?

Metýlenblátt er basískt litarefni: litaða jónin í því ber jákvæða hleðslu. Eins og OpenStax útskýrir í umfjöllun sinni um litun sýna víxlverka basísk litarefni við neikvætt hlaðið frumuefni og geta látið frumur skera sig úr ljósari bakgrunni. Í rétt undirbúnum sýnum dregur metýlenblátt fram svæði sem eru rík af kjarnsýrum og önnur form sem binda litarefnið.

Við einfalda litun myndar eitt litarefni birtuskilin. Margar lífverur geta því litið út fyrir að vera bláar án þess að vera sama lífveran. Gagnlegar spurningar í upphafi snúast um lýsingu: eru hlutirnir kringlóttir eða aflangir, stakir eða í þyrpingum, jafnt litaðir eða með greinilegan innri mun? Skoðaðu muninn á einfaldri litun og Gram-litun áður en þú túlkar lit sem niðurstöðu flokkunar.

Birtuskil og upplausn eru ekki það sama. Birtuskil hjálpa til við að greina hlut frá umhverfi sínu; upplausn gerir kleift að aðgreina smáatriði sem liggja nálægt hvert öðru. Dekkri mynd tryggir ekki að fleiri form séu aðgreinanleg. Ekki er heldur rétt að kalla hvert dökkt korn frumulíffæri.

Ólituð sýni, lituð votpreparöt og strok

Ólitað votpreparat sýnir sýnið án viðbætts litarefnis, þótt það breyti sýninu samt að taka það úr upprunalegu umhverfi sínu. Í lituðu votpreparati er hvarfefni bætt við meðan efnið er enn í vökva undir þekjugleri. Við undirbúning fixeraðs stroks er efni dreift á hlutgler og tiltekin aðferð notuð til að fixera það áður en frekari vinnsla fer fram. Yfirlit OpenStax um sýnaundirbúning greinir á milli votpreparata og fixerunar og útskýrir hvers vegna fixeraðar lífverur sýna ekki lengur eðlilega hreyfingu eða efnaskipti.

Þessar aðferðir við sýnaundirbúning svara ólíkum spurningum:

Til samanburðar í kennslu skal skrá ólitað sýni áður en annað sýni, litað samkvæmt verklýsingu kennslunnar, er skoðað. Hafðu lýsingu og stillingar við myndatöku sambærilegar. Ef tvær ólíkar frumur eru ljósmyndaðar skaltu lýsa þeim sem dæmum, ekki sem myndum af einni frumu fyrir og eftir litun.

Smásjármyndasafn: þrjú raunveruleg lituð sýni

Þetta myndasafn er sjálfstætt úrval og túlkun á þremur smásjármyndum sem birtar eru með opnum notkunarleyfum. Höfundar heimildanna tilgreina sýnin og litarefnin. Við höfum ekki sjálfstætt staðfest auðkenningu sýnanna. Myndirnar eru birtar óskornar eftir tapslausa umbreytingu í WebP, án viðbættra atriða eða litabreytinga.

Mynd 1: frumur úr kinn manna

Sýni: frumur úr kinn manna. Litarefni: metýlenblátt. Stækkun: 400×, samkvæmt ljósmyndaranum. Kvarðastrik: ekki tiltækt; heimildin gefur ekki upp kvarðaða stærð myndpunkta. Ljósmynd eftir Fritzmann2002, 2017, úr Frumur úr kinn manna (litun með metýlenbláu), birt með leyfinu CC BY-SA 4.0. Þessi endurbirting heldur sama leyfi.

Byrjaðu á stakri frumu: dekkri kjarni hennar er auðveldari að greina frá bláa umfryminu í kring. Skoðaðu síðan frumurnar fyrir neðan hana sem skarast. Skörun gerir erfiðara að fylgja mörkum og getur myndað dekkra svæði á tilteknum stað. Notaðu þessa mynd til að æfa þig í að rekja útlínur, ekki til að telja hvern dökkan blett sem kjarna. Leiðarvísirinn um athugun á frumum úr kinn útfærir æfinguna fyrir þessa sýnagerð.

Mynd 2: laukfrumur

Sýni: laukfrumur, samkvæmt auðkenningu heimildarinnar. Litarefni: metýlenblátt. Stækkun: „200x“ kemur fyrir í upprunalegu skráarheiti; það hefur ekki verið staðfest sjálfstætt. Kvarðastrik: ekki tiltækt; engin kvörðun er gefin upp. Ljósmynd eftir Alvy16, 2019, úr Laukfruma 200x, birt með leyfinu CC BY 4.0.

Aflöngu hólfin mynda skipulegt lag. Berðu löng sameiginleg mörk þeirra saman við óreglulegu útlínurnar á mynd 1. Taktu einnig eftir áberandi dökka efninu og ójafnri birtu í sjónsviðinu. Ljósmyndin staðfestir ekki hvað hver dökk útfelling er. Hún sýnir hvers vegna gagnleg athuganaskrá tekur til sýnisgalla og óvissu í stað þess að auðkenna allt sem tekur við lit.

Mynd 3: ger sem heimildin auðkennir sem Candida spp.

Sýni: Candida spp., samkvæmt ljósmyndaranum. Litarefni: einföld jákvæð litun með metýlenbláu. Stækkun: ekki tiltæk. Kvarðastrik: ekki tiltækt; engin kvörðuð stærð myndpunkta er gefin upp. Ljósmynd eftir Marta, Wikimedia-notandann Martunia.g, 2021, úr Jákvæð litun með metýlenbláu 2, birt með leyfinu CC BY 4.0.

Berðu þéttu bláu þyrpingarnar saman við jaðrana þar sem hlutirnir liggja gisnar. Auðveldara er að fylgja einstökum útlínum þar sem minni skörun er. Heitið Candida kemur úr heimildaskráningunni, ekki úr tegundagreiningu sem gerð var á þessari ljósmynd. Þessi mynd gefur heldur enga niðurstöðu um lífvænleika. Próf á lífvænleika og öndun gers krefjast eigin skilyrða, viðmiðunarsýna og túlkunar.

Rétt túlkun kvarða

Þessar myndir nýtast til sjónræns samanburðar, ekki til mælinga í míkrómetrum eða samanburðar á raunverulegri stærð frumna milli mynda. Uppgefin stækkun kemur ekki í stað kvörðunar myndavélar sem vantar. Ef birtingarstærð myndar er breytt breytist stækkunin sem hún virðist sýna.

Fyrir eigin myndir skaltu kvarða mælingar með þekktum staðli og þeim sjónbúnaði sem er notaður. Leiðarvísir Nikon um lengdarmælingar í smásjá útskýrir hvernig kvarðað hlutgler umbreytir handahófskenndum deilingum á mynd eða mælineti í raunverulegar lengdir. Skráðu hlutlinsuna, uppsetningu myndavélarinnar og kvörðunina og bættu við kvarðastriki út frá þeim gögnum. Ekki áætla kvarðastrik út frá meðalstærð frumna í kennslubók.

Passar flaskan við aðferðina?

Flaska merkt metýlenbláu er ekki fullnægjandi tæknilýsing fyrir rannsóknarstofu. Athugaðu styrk og einingar, leysi, viðbætt innihaldsefni, ætlað notkunarsvið, lotuskjöl og leiðbeiningar. Öryggisblað hvarfefnis lýsir hættum; leiðbeiningar aðferðarinnar segja til um hvernig eigi að nota það við fyrirhugaðan sýnaundirbúning.

Áþreifanlegt dæmi er Löffler-metýlenbláttlausn frá Merck. Framleiðandinn skilgreinir hana sem hvarfefni til smásjárskoðunar og lýsir hlutverki hennar sem mótlitarefnis við sýruheldnislitun. Uppgefin eldfimi hennar sýnir einnig hvers vegna „blár vökvi“ er ekki nægileg lýsing til að skipuleggja meðhöndlun eða hitun. Þessir eiginleikar eiga við um þessa samsetningu, ekki sjálfkrafa um allar vatnslausnir af metýlenbláu.

Á sama hátt er eósín-metýlenblátt agar samsettur ræktunarmiðill. Það er ekki litunarefni fyrir hlutgler sem verður til með því að bæta hreinu metýlenbláu við sýni. Ef markmiðið með myndgerðinni er annað skaltu bera saman valkosti við metýlenblátt til smásjárskoðunar.

Þegar smásjársett fyrir byrjendur er notað skaltu byrja á skjalfestri kennsluaðferð þess, þekktum tilbúnum smásjársýnum og tilgreindu hvarfefni. Ef merkimiði hefur tapast af flösku eða ekki er hægt að staðfesta samsetningu hennar skaltu skipta henni út fyrir viðeigandi hvarfefni með tilheyrandi gögnum. Notaðu augnhlífar og fylgdu leiðbeiningum um meðhöndlun sem fylgja þeirri samsetningu sem raunverulega er notuð. Efni úr mönnum og óþekkt umhverfissýni krefjast þess að verklagsreglum kennslurannsóknarstofunnar um meðhöndlun og förgun sýna sé fylgt; litun kemur ekki í stað þeirra reglna.

Skráðu athugunina á undan ályktuninni

„Bláir sporöskjulaga hlutir í þyrpingum“ er verjanleg lýsing á mynd. „Tiltekin sýking“ krefst gagna sem myndin hefur ekki veitt. Haltu uppruna sýnis, sýnaundirbúningi, litunarviðbrögðum og auðkenningaraðferð aðskildum í vinnubókinni. Sá greinarmunur gerir einfalda mynd úr kennslustund gagnlega og kemur í veg fyrir að falleg smásjármynd sé látin styðja fullyrðingu sem hún getur ekki staðið undir.