Hvernig metýlenblátt kemst inn í frumur: afoxun, enduroxun og upptaka

Ef þú horfir á æðaþelsfrumur í ræktunarskál taka upp metýlenblátt er augljósa túlkunin jafnframt röng. Ætið missir bláa litinn og blá korn birtast í frumunum, svo litarefnið hlýtur að hafa farið í gegnum himnuna sem blá sameind. Tilraunirnar segja annað. Bláa formið kemst varla yfir. Það sem fer yfir er litlausa formið, og blái liturinn sem þú sérð inni í frumunni verður til þar, eftir að efnið er komið inn.

Þessi viðsnúningur skiptir máli vegna þess að hann ræður því hvað litun getur og getur ekki sagt okkur. Blá korn sýna oxað litarefni sem hefur enduroxast og lokast inni í frumulíffærum. Þau sýna ekki heildarmagn litarefnis í frumunni, þau sýna ekki afoxaða forðann og þau mæla ekki líffræðileg áhrif. Til að skilja hvers vegna þarf að fylgja þrepunum þremur: afoxun á yfirborði, flæði afoxaða formsins, enduroxun og innilokun inni í frumunni.

Formin tvö hegða sér eins og ólíkar sameindir

Oxað metýlenblátt er flatt, jákvætt hlaðið hringakerfi. Það leysist upp í vatni, gleypir ljós sterklega við um 600 til 700 nanómetra og er blátt að sjá. Hleðslan er lykilatriðið. Hlaðin, vatnssækin sameind smýgur ekki auðveldlega í gegnum lípíðhimnu, svo varfærna orðalagið í fræðiritum er að himnan sé tiltölulega lítt gegndræp fyrir henni, ekki ógegndræp.

Afoxað metýlenblátt, sem kallast leúkómetýlenblátt, er litlaust, óhlaðið og fituleysanlegt. Þegar hleðslan hverfur hættir himnan að vera veggur. Afoxaða sameindin flæðir auðveldlega yfir, og þegar hún er komin inn í hólf með meira oxandi umhverfi getur hún aftur tapað rafeindum og farið yfir í bláa, hlaðna formið sem lokast inni. Redox-efnafræði litarefnisins er því jafnframt flutningsferli þess. Ef rafeindafjöldinn breytist breytist gegndræpið líka.

Rafeindirnar í fyrsta þrepið koma frá frumunni sjálfri. Spendýrafrumur flytja rafeindir yfir frumuhimnuna og færa afoxunarígildi frá gjöfum innan frumunnar út til viðtakenda á yfirborðinu. Þessi virkni yfir frumuhimnuna er eðlileg frumustarfsemi sem finnst í flestum frumugerðum. Afoxunarensímið á yfirborði æðaþelsfrumna sem vinnur með tíazínlitarefni líkist öðrum slíkum ensímum að einu mikilvægu leyti: það heldur áfram að starfa í nærveru sýaníðs og asíðs í skömmtum sem stöðva síðari þrepin. Þessi aðgreining er lykillinn að allri sögunni.

Dreifing milli fasa kom fyrst og skýrði næstum upptökuna

Árið 1929 lagði Marian Irwin við Rockefeller-stofnunina fram einfaldari spurningu. Kannski fælist innkoma litarefnis einfaldlega í dreifingu milli vatns og fituríkra laga frumunnar, og klóróformlag gæti komið í stað þessara fituríku laga í tilraun. Í rannsóknum hennar á íferð með ljósgleypnimælingum voru vatnslausnir litarefna hristar með klóróformi og borið saman hvað færðist yfir í lífræna fasann og hvað komst inn í lifandi þörungafrumur.

Tvær niðurstöður þeirrar vinnu eiga enn skilið athygli. Í fyrsta lagi innihéldu metýlenblálausnir á markaði trímetýltíónín, sem nú kallast azure B, og þetta óhreinindaefni komst hraðar inn en metýlenblátt sjálft, sérstaklega við basískt pH þar sem fituleysanlegt form frjálsa basans er ríkjandi. Hluti þeirrar innkomu sem virtist vera metýlenblátt var í raun sértæk innkoma azure B. Í öðru lagi réð pH niðurstöðunni með því að ákvarða jónunarástandið, og skaddaðar frumur hleyptu inn mun meira litarefni en óskaddaðar. Dreifistuðlar og hleðsluástand stjórnuðu því hvað tilraunakerfið og lifandi fruman tóku hvort um sig upp, og líkindin þar á milli studdu hugmyndina um lög án vatns við frumumörkin.

Líkanið var framsýnt varðandi lípíð og jónun, en það gat ekki greint á milli litarefnis sem dreifist óbreytt milli fasa og litarefnis sem umbreytist efnafræðilega á yfirborðinu, fer yfir í dulargervi og umbreytist aftur inni í frumunni. Til þess þurfti annars konar tilraun, og hún kom sjötíu árum síðar í æðaþeli lungna.

Afoxun utanfrumu, innilokun innanfrumu

Merker og samstarfsfólk unnu með ræktaðar æðaþelsfrumur úr lungnaslagæðum nautgripa og lögðu til þriggja þrepa ferli: oxaða litarefnið afoxast á yfirborði frumunnar í litlaust, fitusækið form sitt, afoxaða formið flæðir inn og enduroxun innan frumunnar endurmyndar oxaða formið sem kemst ekki yfir himnuna og safnast því upp. Í rannsókn þeirra á upptöku tíazínlitarefna í æðaþelsfrumum var þetta ferli síðan prófað með því að reyna að rjúfa það á tilteknum stöðum.

Fyrsta verkfærið var ferrísýaníð, rafeindaviðtakandi sem kemst ekki inn í frumuna. Þegar yfirborðsensím afoxa blátt litarefni í litlausa formið utan frumunnar getur ferrísýaníð tekið rafeindirnar aftur og endurmyndað blátt litarefni í ætinu áður en það kemst yfir. Svo lengi sem ferrísýaníð var í umframmagni (10 míkrómólar af litarefni á móti 50 til 500 míkrómólar af ferrísýaníði) stöðvaðist upptaka litarefnis nánast alveg. Hún hófst ekki aftur á eðlilegum hraða fyrr en ferrísýaníðið hafði gengið til þurrðar. Hraðafræðin sagði sömu sögu á annan hátt. Ferrísýaníð hvarf á nokkurn veginn jöfnum hraða, í samræmi við stöðugt afoxunarflæði á yfirborðinu sem nærði endurvinnanlegan miðlara, en litarefni utan frumunnar hvarf með veldisvísisfalli eftir því sem forði þess tæmdist. Stöðugt flæði ásamt minnkandi forða þýðir að ferrísýaníðmerkið sýnir samfellda afoxun, ekki litarefnissameindir sem hverfa úr lausninni.

Annað verkfærið fjarlægði þrepið þar sem farið er yfir himnuna alveg. Hópurinn tengdi tólúidínblátt O, náskylt tíazínlitarefni, við stóra pólýakrýlamíðkeðju sem var of stór til að komast inn í frumuna í hvoru oxunarástandi sem er. Frumurnar afoxuðu samt bundna litarefnið. Afoxun krefst því ekki aðgangs að innanverðri frumunni. Afoxunarbúnaðurinn er aðgengilegur á yfirborðinu eða raftengdur því.

Þá kom að aðgreiningunni sem gefur greininni heiti sitt. Sýaníð og asíð við 2 millimólar drógu mjög úr uppsöfnun litarefnis, og í smásjá hurfu nær alveg dökkbláu og fjólubláu innlyksurnar sem venjulega umkringja kjarnann. Hvorugur hemillinn hægði þó á afoxun utan frumunnar: hringrás ferrísýaníðs hélt áfram óskert og fjölliðan sem komst ekki yfir himnuna afoxaðist enn. Hindrunin var í síðari þrepum. Sýaníð og asíð stöðvuðu enduroxun og innilokun innan frumunnar, ekki afoxun á yfirborðinu. Lífvænleikaprófanir studdu þessa túlkun, því frumurnar héldu eftir umfrymisensíminu laktatdehýdrógenasa við þessar meðferðir. Minni upptaka var því ekki einfaldlega vegna eitrunar eða rofs á himnunni.

Einn fyrirvari úr greininni á enn við. Bláu innlyksurnar voru umhverfis kjarnann en ekki í honum, sem samræmist oxun inni í frumulíffærum, en rannsóknin greindi ekki hvaða frumulíffæri það voru. Svipuð mynstur í öðrum frumugerðum höfðu verið talin tengjast leysikornum á veikum forsendum. Líta ber á innilokunina sem staðfesta en staðsetninguna sem óstaðfesta. Lesendur sem fylgjast með því hvert rafeindirnar fara næst geta haldið áfram að lesa um rafeindaflutning í hvatberum og redox-ferli og heildarmyndina af frásogi og dreifingu eftir íkomuleið.

Litun er ekki útsetning

Þriðja rannsóknin sýnir hvað gerist þegar þessi upptökulógík er borin saman við líffræðilega mælingu. Scott og samstarfsfólk komust að því að metýl-beta-sýklódextrín, hringlaga sykursameind, bindur metýlenblátt beint. Tengingarfastinn fyrir innlyksunarfléttuna var um 310 fyrir hvert mól á lítra, samanborið við um 5846 fyrir hvert mól á lítra fyrir tvíliðun litarefnisins. Í L929 bandvefsfrumum hindraði þessi binding bæði litun frumna og örvun glúkósaupptöku: formeðhöndlun með sýklódextríninu kom í veg fyrir bláa litun, og þegar því var bætt við eftir á hraðaði það aflitun. Þegar bláa ljósmerkið hvarf úr frumunum dvínaði aukinn glúkósaflutningur í nánu samhengi við það.

Höfundarnir túlkuðu þessa fylgni þannig að hún styddi frekar bein víxlverkun milli litarefnisins og próteins í ferlinu sem virkjar glúkósaflutningsprótein en langvarandi ferli sem byggist á oxunarálagi. Sú ályktun er eðlileg en takmörkuð. Tilraunin greinir ekki hvaða prótein á í hlut, sýnir ekki bindingu við flutningspróteinið sjálft, og fylgni milli aflitunar og minnkandi áhrifa getur ekki útilokað allar leiðir sem miðlast af redox-ferlum.

Varanlegi lærdómurinn snýst um mælingar. Ljósræn litun sýnir sýnilegt, oxað litarefni sem tengist frumum. Hún nær alls ekki til litlausa, afoxaða forðans, svo dauflega lituð fruma getur enn innihaldið litarefnisígildi. Sterkt lituð fruma sýnir hins vegar innilokað, oxað litarefni fremur en heildarútsetningu vefja eða stærð áhrifa. Sami fyrirvari gildir á stærri skala: að bera saman litun ólíkra frumugerða eða líta á dökkan vefjaskurð sem sönnun fyrir meiri útsetningu endurtekur upphaflegu mistúlkunina á því sem gerðist í ræktunarskálinni. Upptaka er hringrás afoxunar, flæðis og enduroxunar, og hver einstök svipmynd af bláa forminu sýnir aðeins einn hluta hennar. Hagnýtar afleiðingar fyrir litun og meðhöndlun á rannsóknarstofu og túlkun fullyrðinga um skammta og útsetningu leiða beint af þessu.