Siapa yang mengembangkan pewarna darah ungu? Metilen biru, Malachowski, Romanowsky, dan Giemsa

Eosin berwarna merah. Metilen biru berwarna biru. Campurkan keduanya, aplikasikan campuran tersebut pada film darah kering, dan sebagian bagian film akan berubah menjadi ungu.

Tidak semua bagian. Dalam preparat yang baik, inti sel darah putih menjadi merah-ungu, dan di dalam parasit malaria kromatin mengambil warna yang sama, sementara sel darah merah di sekitarnya tetap merah muda dan sitoplasma tetap biru-keabu-abuan. Warna ungu inilah yang membuat jenis sel dapat dibedakan.

Tidak ada botol yang berisi warna ungu. Warna tersebut hanya muncul ketika produk pemecahan tertentu dari metilen biru bertemu eosin pada kaca preparat, dan pada tahun 1880-an serta 1890-an tidak ada yang mengetahui bahwa produk tersebut ada, apalagi apa sebenarnya kandungannya. Orang-orang yang mengejar warna ini bekerja dengan pewarna tidak murni, sendirian, tanpa cara yang dapat diandalkan untuk mengetahui isi botol setelah botol tersebut berada di rak selama dua bulan.

Itulah sebabnya pertanyaan pada judul memiliki lebih dari satu jawaban yang dapat dipertahankan, dan mengapa jawabannya berubah pada 2011.

Pembacaan yang berubah bersama campuran

Pewarna ini tidak ditemukan sekaligus. Pewarna ini terakumulasi. Setiap perubahan pada campuran memberikan tepat satu informasi visual baru, dan urutan perubahan tersebut adalah cara paling jelas untuk membaca sejarahnya.

Pola pada kolom terakhir adalah hal yang penting. Setiap kemajuan memperluas rentang warna, dan setiap perluasan membuat satu struktur tambahan terlihat. Warna ungu bukan hiasan pada teknik ini; warna tersebut adalah perbedaan antara melihat bahwa parasit ada dan melihat dari apa parasit tersebut tersusun. Bagaimana pewarna itu berpindah dari pabrik pewarna BASF ke dunia medis adalah sejarah yang lebih panjang dengan dokumennya sendiri. Urutan lengkap di atas, dengan sumber di balik setiap entri, disimpan sebagai linimasa kontributor yang terhubung ke sumber.

Gambar: enam campuran yang sama digambarkan sebagai apa yang ada di wadah dan apa yang dihasilkan. Lingkaran membawa pewarna; blok di bawahnya membawa warna yang dapat dihasilkan pewarna tersebut pada film darah. Tidak ada sebelum 1890 yang menggambar blok merah-ungu, dan tidak ada setelahnya yang menghilangkannya.

Orang yang menggunakan boraks dengan sengaja

Ernst Malachowski adalah seorang dokter di Breslau, sekarang Wrocław, yang menghabiskan kariernya dalam praktik pribadi dan di klinik kecil yang ia jalankan bersama seorang kolega, melakukan pekerjaan laboratorium pada waktu luangnya. Ia lahir di Strzelno pada 12 Maret 1857, mempelajari kedokteran di Universitas Breslau, dan bekerja dari 1882 hingga 1887 sebagai asisten bidang penyakit dalam di All Saints Hospital, yang saat itu merupakan rumah sakit terbesar kedua di Jerman.

Ia memulai pada 1888 dengan pewarna ganda Chęciński dan Plehn. Dalam sebuah preparat yang dibuat pada 1889 ia melihat kromatin inti plasmodium diwarnai berbeda dari sitoplasma, lalu menemukan bahwa ia tidak dapat mengulanginya. Ia mencoba membuat metilen biru lebih asam, yang memperburuk hasil. Ia mencoba membuatnya lebih basa dengan boraks, yang berhasil setiap kali. Ia mendemonstrasikan metode tersebut secara terbuka pada 15 Juni 1890 dan menerbitkan deskripsi yang lebih lengkap pada Agustus 1891, termasuk instruksi penggunaan boraks. Ia mencatat bahwa pewarnaan memerlukan waktu dua puluh empat jam dan hasilnya mudah direproduksi.

Dua puluh empat jam adalah waktu yang lama dalam laboratorium diagnostik, dan makalahnya tidak banyak membahas warna merah-ungu pada inti parasit. Apa pun alasannya, tidak ada yang menggunakan alkalinisasi metilen biru secara sengaja sampai Nocht melakukannya lagi pada 1898. Malachowski tidak pernah menulis tentang pewarnaan darah lagi.

Alasan mengapa begitu sedikit yang diketahui tentang dirinya hingga baru-baru ini bersifat arsip, bukan misterius. Hampir tidak ada jejak hidupnya yang tersisa dalam literatur medis, dan yang tersisa datang melalui satu jalur. Putrinya Marie meninggalkan Jerman menuju London pada 1939, bertugas di Angkatan Darat Inggris, lalu menetap di Kanada, dan koleksi dokumen keluarga miliknya akhirnya berada di Leo Baeck Institute di New York. Saudaranya Leo tewas dalam Perang Dunia Pertama. Saudarinya Eva dideportasi dari Breslau ke kamp transit Izbica pada April 1942 dan tidak pernah kembali. Ibunya Hedwig mengakhiri hidupnya sendiri pada 22 April 1942 daripada menunggu deportasi yang sama. Malachowski telah meninggal pada 1934, sebelum semua peristiwa itu.

Sejarah keluarga yang berakhir seperti itu adalah sejarah keluarga yang berhenti dikutip. Dua makalah yang mengembalikan Malachowski ke dalam perkembangan pewarna ini, keduanya diterbitkan pada 2011, disusun dari dokumen arsip di Poznań dan Wrocław serta dari dokumen Marie di New York.

Botol berjamur dan seorang Rusia yang beruntung

Dmitri Romanowsky mempelajari kedokteran di Akademi Medis Militer di St Petersburg dan bekerja pada malaria hampir sepanjang kariernya. Pada 1890 ia menerbitkan metode yang secara teori hampir identik dengan metode Chęciński: metilen biru dan eosin tanpa perubahan, dengan sedikit lebih banyak eosin.

Pada September 1891 ia menerbitkan metode yang membuat namanya dikenal, dan detail penting tersembunyi dalam instruksi. Hasil terbaiknya berasal dari die vorräthige Methylenlösung, larutan stok metilen biru yang telah dibiarkan selama lebih dari dua bulan dengan pertumbuhan jamur di dalamnya. Jamur dan waktu penyimpanan telah menyebabkan sebagian demetilasi pewarna. Romanowsky tidak mengetahui hal tersebut dan tidak dapat mengendalikannya, dan peneliti lain yang mencoba metodenya tidak dapat memperoleh warna ungu. Tesisnya telah diajukan di St Petersburg pada Juni 1891, sehingga catatan standar menganggap 1891 sebagai tahun penemuan.

Demonstrasi Malachowski telah dilakukan pada Juni 1890, lebih dari satu tahun sebelumnya, dan metodenya bekerja dengan sengaja.

Mengapa eponim diberikan kepada orang yang keliru

Kasus untuk Malachowski disusun oleh Kristine Krafts, Ernst Hempelmann dan Barbara Oleksyn, dan bergantung pada empat hal. Tanggal demonstrasi publik, Juni 1890 dibandingkan September 1891. Kata sengaja dibandingkan kata kebetulan. Fakta bahwa Malachowski menerbitkan metodenya, lengkap dengan boraks, sementara metode Romanowsky bergantung pada variabel yang tidak terkendali. Dan pengamatan bahwa deskripsi inti plasmodium, bersama warna ungu yang mengungkapkannya, pada dasarnya menghilang dari literatur selama tujuh tahun karena tidak ada yang dapat mereproduksi versi yang tidak sengaja tersebut.

Mereka menyatakan kesimpulannya dengan tegas. Dalam makalah biografi mereka menyebut atribusi tersebut "a travesty", dan mengutip Ralph Lillie, yang pada 1978 menulis bahwa "perhaps we should refer to this family of stains as Malachowski stains".

Klaim tersebut diperdebatkan, seperti biasanya klaim prioritas, dan bentuk perdebatannya perlu dijelaskan daripada diselesaikan. Argumen tentang prioritas harus menyatakan apa yang dimaksud dengan penemuan. Jika penemuan adalah warna ungu, Malachowski memiliki demonstrasi terdokumentasi lebih awal. Jika penemuan adalah metode yang diterbitkan, kedua orang tersebut menerbitkan pada 1891 dan eponim diberikan kepada Romanowsky. Jika penemuan adalah penjelasan, tidak satu pun dari mereka memiliki klaim, karena tidak satu pun mengetahui bahwa pematangan adalah demetilasi dan tidak satu pun dapat menjelaskan mengapa warna tersebut muncul. Poin terakhir itulah yang dilewatkan oleh catatan populer. Bahan aktifnya adalah pengotor yang belum diidentifikasi, dan orang pertama yang menghasilkan warna tersebut secara sengaja melakukannya dari resep empiris yang dapat direproduksi, bukan dari pemahaman tentang apa yang dilakukan resep tersebut.

Dua makalah tahun 2011 adalah pernyataan terlengkap yang diterbitkan mengenai kasus Malachowski, dan keduanya dapat dibaca gratis di PubMed: ulasan panjang di PMID 21235291 dan makalah biografi di PMID 21660627. Catatan PubMed untuk ulasan tersebut juga mencantumkan komentar tentangnya, diterbitkan dalam jurnal yang sama pada tahun itu di 86(5):366, yang menjadi pengingat bahwa argumen tersebut diperdebatkan dalam publikasi segera setelah muncul.

Yang bukan merupakan perbedaan dalam sengketa ini adalah ketidaksepakatan tentang kimia. Semua pihak setuju tentang apa yang menghasilkan warna ungu dan komponen mana yang menghasilkan warna tersebut. Perbedaannya adalah siapa yang sampai lebih dahulu, dan apakah sebuah kecelakaan yang tidak dapat diulang dianggap sebagai pencapaian yang sama.

Apa yang diberikan oleh nama-nama berikutnya

Jika Malachowski menghasilkan warna ungu lebih dahulu, mengapa pewarna ini membawa nama Romanowsky, Wright dan Giemsa?

Karena pewarna yang hanya bekerja sekali di tangan penciptanya bukanlah reagen. Pekerjaan berikutnya mengubah campuran yang sulit dikendalikan menjadi sesuatu yang dapat digunakan teknisi di negara lain pada hari Selasa.

Nocht sampai di sana melalui penalaran. Setelah gagal mendapatkan jawaban yang dapat diandalkan dari pewarna netral sederhana, ia menyimpulkan bahwa warna ungu pasti berasal dari sesuatu dalam metilen biru yang bukan metilen biru, lalu mencarinya. Unna sebelumnya telah memperhatikan bahwa larutan metilen biru yang sudah tua mewarnai granula sel mast menjadi merah, dan mengusulkan bahwa zat baru terbentuk ketika pewarna tersebut matang. Bernthsen telah menunjukkan pada 1885 bahwa kondisi basa melepaskan gugus metil dari metilen biru, dan bahwa produk ini adalah apa yang sekarang disebut azure. Nocht mengekstrak fraksi aktif dengan kloroform dan hanya dapat menyebutnya Rot aus Methylenblau, merah dari metilen biru; Michaelis menamakannya azure I pada 1901. Jenner menyelesaikan masalah logistik. Melarutkan kembali endapan metilen biru dan eosin dalam metanol absolut menghasilkan satu larutan stabil yang memperbaiki film saat mewarnai dan mengakhiri fiksasi panas. Leishman dan Reuter menggabungkan pewarna polikrom dengan pelarut alkohol dan mendapatkan stabilitas serta warna ungu sekaligus. Wright mengganti inkubasi dua belas jam pada 65 °C dan penyimpanan sepuluh hari dengan satu jam dalam uap mengalir. Giemsa berhenti bergantung pada larutan yang matang secara acak, menggunakan jumlah terukur dari pewarna yang diketahui dengan gliserol dalam metanol sehingga produk bertahan terhadap panas tropis. Ia tidak pernah menerbitkan cara membuat metilen azure murni. Ia menjualnya kepada laboratorium Dr Grübler di Leipzig, yang memasarkannya sebagai azure I dan menyatakan bahwa hanya versinya yang merupakan pewarna Giemsa asli.

Identitas azure tersebut masih diperdebatkan. Sebagian berpendapat bahwa itu hanya metilen biru polikrom, sementara yang lain berpendapat bahwa itu kaya akan azure B. Jawabannya muncul dari sebuah perang. Ketika pewarna Jerman tidak dapat diperoleh, tim United States Public Health Service, Ralph Lillie bersama Maurice Roe dan Aimee Wilcox, menemukan bahwa pewarnaan terbaik berasal dari tiga komponen yang dipisahkan: metilen biru tidak termodifikasi, produk pemecahan demetilasinya azure B, dan eosin. Azure B menggantikan azure I yang tidak tersedia, dan ketiga komponen tersebut masih menjadi dasar pewarna yang digunakan untuk mendiagnosis malaria saat ini.

Kimia tentang bagaimana ketiga