Metilen biru untuk pewarnaan DNA dan RNA: aplikasi gel dan membran

Seorang mahasiswa menjalankan gel agarosa, mewarnainya dengan metilen biru, dan tidak melihat apa pun di tempat yang seharusnya terdapat pita terang. Di area kerja sebelah, seorang peneliti pascadoktoral mewarnai membran Northern dengan botol biru yang sama dan memperoleh pita ribosomal yang tajam dalam tiga menit. Mahasiswa itu menyimpulkan bahwa gelnya gagal. Gelnya tidak gagal. Kedua tugas tersebut berbeda, dan pewarna yang sama memberikan hasil dengan sensitivitas, latar belakang, dan aturan tahap lanjutan yang berbeda.

Pewarna DNA metilen biru dan pewarnaan RNA metilen biru memiliki kimia yang sama tetapi tujuan yang berbeda. Dalam gel, pewarna menunjukkan berapa banyak asam nukleat yang berada di dalam matriks berpori. Pada membran, pewarna menunjukkan apakah transfer berhasil dan apakah lajur dimuat secara merata. Setelah perbedaan ini jelas, protokol, batas deteksi, dan batas kompatibilitas menjadi lebih mudah dipahami.

Jawaban singkat

Metilen biru adalah pewarna kationik planar yang berikatan dengan asam nukleat secara nonkovalen dan reversibel, melalui kombinasi tarikan elektrostatik terhadap fosfat, interkalasi di antara pasangan basa, dan asosiasi dengan alur minor. Sifat reversibel itulah poin utamanya. Pita dapat diwarnai dan diamati dengan cahaya tampak, didokumentasikan, lalu dihilangkan warnanya atau dibersihkan untuk kloning, hibridisasi, atau probing ulang.

Untuk pewarnaan gel agarosa DNA untai ganda dengan metilen biru, resep cepat standar adalah 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) dalam air, sekitar 15 menit pewarnaan ditambah sekitar 15 menit penghilangan warna dengan air, lalu diamati pada kotak cahaya putih. Untuk membran, resep klasik Northern blot adalah 0.02 hingga 0.04 percent pewarna dalam sodium acetate mendekati pH 5.2, beberapa menit pewarnaan setelah transfer dan imobilisasi, lalu pembilasan dengan air dan penghilangan warna sepenuhnya sebelum hibridisasi. Sensitivitasnya sedang: puluhan hingga ratusan nanogram per pita gel dalam kondisi yang baik, dan panduan konservatif mencantumkan 0.5 hingga 1 microgram. Nilai ini beberapa orde magnitudo di atas ethidium bromide dan pewarna SYBR. Pada membran, tidak ada satu batas deteksi transkrip yang berguna karena pewarna terutama menampilkan RNA ribosomal yang melimpah dan total material yang dimuat. Jangan mengganti salah satu resep tersebut dengan larutan suplemen ritel. Metode yang tervalidasi mengasumsikan pewarna analytical grade, buffer yang terdefinisi, dan penanganan bebas RNase ketika melibatkan RNA.

Cara kerja pengikatan, dan kapan hal itu menyesatkan

Model yang berguna memiliki tiga bagian. Pertama, sistem cincin bermuatan positif tertarik pada tulang punggung fosfat bermuatan negatif. Penelitian spektroskopi menemukan bahwa komponen elektrostatik ini dominan pada kadar garam rendah, sementara pemodelan dan dinamika molekuler tetap menunjukkan interkalasi dan pengikatan pada alur minor sebagai mode stabil untuk DNA untai ganda, sebagaimana dirangkum dalam penelitian spektroskopi tentang pengikatan DNA oleh metilen biru. Kedua, terdapat sedikit preferensi terhadap GC, dengan pemodelan yang lebih mendukung langkah CpG dan GpC serta eksperimen yang melaporkan asosiasi preferensial dengan dupleks kaya GC dalam penelitian mengenai preferensi interkalasi metilen biru, tetapi dupleks AT juga berikatan. Pewarnaan rutin tidak spesifik terhadap sekuens. Ketiga, DNA untai tunggal dan RNA berikatan terutama melalui interaksi elektrostatik dan stacking dengan basa yang dapat diakses serta daerah dupleks, sehingga kekuatan pewarnaan bervariasi menurut panjang, sekuens, dan struktur sekunder.

Ada dua konsekuensi. Karena pengikatannya nonkovalen, pewarna dapat tercuci keluar. Pita polyacrylamide cepat memudar kecuali sengaja difiksasi, dan varian fiksasi permanen khusus tersedia justru karena pewarnaan normal bersifat sementara, sebagaimana dijelaskan oleh Soto dan Draper untuk gel PAGE. Karena pewarna ini merupakan fotosensitizer, paparan lama terhadap pencahayaan terang pada DNA yang telah diwarnai dengan adanya oksigen dapat mengoksidasi guanine dan pada akhirnya menyebabkan nick pada untai, suatu mekanisme yang dijelaskan secara terperinci dalam penelitian tentang oksidasi guanine yang disensitisasi oleh metilen biru. Pengamatan singkat dengan cahaya putih menghindari kerusakan UV yang sudah dikenal pada alur kerja ethidium bromide klasik, dan keuntungan tersebut nyata untuk pemulihan preparatif. Cahaya tampak lebih lembut, bukan tanpa risiko. Batasi pencahayaan ketika DNA akan dikloning. Untuk fotokimia yang lebih luas di balik peringatan ini, lihat dua jalur dalam fotokimia metilen biru. Untuk pasangan redoks dan keadaan muatan yang menjelaskan mengapa bentuk teroksidasi berikatan sedangkan bentuk tereduksi tidak, lihat kimia struktur dan sifat metilen biru.

Tugas pertama: pewarnaan di dalam gel

Pewarnaan gel menjawab satu pertanyaan: apakah terdapat cukup asam nukleat dalam pita ini untuk terlihat dengan mata. DNA untai ganda dalam agarosa merupakan kasus yang paling banyak dikarakterisasi. Metode gel metilen biru asli dari Flores dan rekan-rekan memvalidasi protokol cepat 0.02 percent pada 1 percent agarose dan menunjukkan keberhasilan pemulihan serta kloning setelahnya. Protokol pemasok yang sama tersedia pada halaman produk metilen biru IBI Scientific, yang mencantumkan resep membran 0.04 percent dan varian gel cepat secara berdampingan.

Alur kerja praktis:

1. Jalankan gel seperti biasa. Warnai setelah elektroforesis, bukan selama proses tersebut, kecuali transfer atau resolusi telah divalidasi untuk metode yang dimodifikasi.
2. Rendam dalam 0.02 percent w/v metilen biru dalam distilled water, dengan pengadukan lembut, sekitar 15 menit.
3. Hilangkan warna dengan beberapa kali penggantian air, sekitar 15 menit total, hingga latar belakang matriks berkurang dan pita tampak jelas.
4. Foto segera pada iluminator cahaya putih.

Agarosa dan polyacrylamide berperilaku berbeda. Agarosa mempertahankan pewarna dalam matriks, sehingga penghilangan warna menjadi tahap yang lambat. Gel polyacrylamide tipis cepat terwarnai tetapi juga cepat kehilangan pewarna, yang membantu eksisi preparatif tetapi merugikan dokumentasi arsip. Oligonukleotida sintetis dalam polyacrylamide dapat dilokalisasi dengan resep 0.02 percent yang sama dalam 20 hingga 30 menit dengan pembilasan air berulang, mengikuti metode PAGE bergaya Current Protocols yang telah mapan. Varian yang sangat encer mendekati 0.0002 percent dalam TBE encer telah dilaporkan untuk oligo preparatif selama beberapa jam, tetapi dasar buktinya lebih lemah.

Perbedaan antara DNA dan RNA penting. DNA untai ganda memberikan pengikatan terstruktur yang paling kuat. RNA dan DNA untai tunggal juga terwarnai, tetapi lebih lemah dan kurang dapat diprediksi. Untuk gel RNA agarosa formaldehyde, sebagian besar laboratorium melewati pewarnaan biru di dalam gel dan terlebih dahulu memindahkan RNA ke membran, lalu mewarnainya di sana. Langkah ini menukar sinyal gel yang lemah dengan sinyal membran yang lebih tajam sekaligus menghasilkan catatan pemuatan.

Tugas kedua: pewarnaan pada membran

Pewarnaan membran menjawab pertanyaan yang berbeda: apakah transfer berhasil, dan apakah lajur dapat dibandingkan. Aplikasi klasiknya adalah pewarna Northern blot reversibel Herrin dan Schmidt, yang semula menggunakan 0.04 percent pewarna dalam 50 mM sodium acetate pada pH 5.0 selama 2 hingga 3 menit dengan pembilasan air, dan dapat dihilangkan menggunakan SDS encer dalam SSPE sebelum hibridisasi.

Varian modern yang banyak digunakan berjalan sebagai berikut:

1. Transfer RNA atau DNA terdenaturasi ke nylon atau nitrocellulose, lalu imobilisasi dengan UV crosslinking atau pemanasan agar sampel tidak hilang selama pewarnaan.
2. Opsional tetapi umum: basahi membran dalam 5 percent acetic acid selama sekitar 15 menit.
3. Warnai selama 5 hingga 10 menit dalam 0.02 hingga 0.04 percent metilen biru dalam 0.3 hingga 0.5 M sodium acetate mendekati pH 5.2.
4. Bilas dan hilangkan warna dalam air selama 5 hingga 15 menit, dokumentasikan, lalu hilangkan sisa pewarna sebelum hibridisasi.

Nylon bermuatan positif mendominasi pekerjaan Northern. Nitrocellulose juga dapat digunakan dengan alur kerja acetic acid ditambah acetate yang sama. Gambar digunakan untuk mengonfirmasi transfer, membandingkan pita 28S dan 18S (atau 23S dan 16S untuk RNA bakteri), menandai ladder dan standar, serta menyimpan catatan kasar normalisasi total RNA. Metode Northern yang dipublikasikan menguantifikasi pita ribosomal yang diwarnai untuk pemeriksaan pemuatan, termasuk penelitian ilmu susu yang menggunakan pita ribosomal metilen biru untuk normalisasi. Membran Southern dapat divisualisasikan dengan cara yang sama, tetapi pewarna ini jauh lebih mapan sebagai pemeriksaan pemuatan dan transfer Northern, dan DNA Southern didenaturasi sebelum transfer, sehingga angka sensitivitas gel tidak dapat langsung diterapkan.

Batas deteksi dan latar belakang: ketika warna biru kalah

Perbandingan di bawah sengaja bersifat perkiraan. Kinerja pewarna bergantung pada persentase gel, lebar pita, optik, dan kedisiplinan penghilangan warna. Perlakukan setiap angka sebagai orde magnitudo, bukan spesifikasi.

Pengendalian latar belakang menentukan apakah sinyal yang sederhana tersebut dapat digunakan. Pewarna bebas memiliki warna yang sangat kuat, sehingga kontras diperoleh dengan menghilangkan pewarna yang tidak terikat tanpa melepaskan pewarna yang terikat. Pewarna yang lebih pekat jarang meningkatkan sensitivitas. Biasanya hanya menambah waktu penghilangan warna. Jalankan seri pengenceran pada gel, membran, dan kamera yang sama persis, lalu gunakan hanya rentang di mana integrated density tetap proporsional terhadap input. Metilen biru mendukung normalisasi pemuatan semikuantitatif. Ini bukan uji kuantitatif dengan dynamic range tinggi karena kapasitas membran, efisiensi transfer, saturasi, dan penghilangan warna bervariasi dari satu lajur ke lajur lain.

Batas kompatibilitas: apa yang tetap bertahan setelah pewarnaan

Kloning setelah pewarnaan biru telah didemonstrasikan. Flores dan rekan-rekan mengeksisi pita agarosa yang telah diwarnai, memulihkan DNA, lalu melakukan ligasi dan transformasi, serta melaporkan hasil kloning yang lebih baik dibandingkan setelah ethidium bromide dengan UV. Alasan yang paling mungkin adalah fotokerusakan yang lebih rendah, bukan manfaat dari pewarna itu sendiri. Jaga paparan cahaya putih tetap singkat dan lakukan pembersihan ekstraksi gel normal pada DNA yang dipulihkan.

PCR dan sequencing memiliki bukti yang lebih terbatas. Sisa pewarna berikatan dengan asam nukleat, sehingga hilangkan warna dan bersihkan sampel sebelum tahap enzimatik. DNA yang dimurnikan dengan benar dari gel biru diperkirakan dapat digunakan, tetapi toleransi terhadap carryover langsung pada berbagai polymerase dan kimia sequencing belum dikuantifikasi dengan baik. Jangan mengasumsikannya.

Hibridisasi blot kompatibel jika urutannya ketat: transfer, imobilisasi, pewarnaan, dokumentasi, penghilangan warna, hibridisasi. Urutan tersebut adalah rancangan Herrin dan Schmidt. Pewarnaan sebelum transfer, atau melewati tahap penghilangan warna, merupakan metode yang berbeda dan memerlukan validasinya sendiri. Setelah pewarna dihilangkan, stripping probe standar dan probing ulang dapat dilakukan secara normal. Untuk pewarnaan tingkat sel dengan keluarga pewarna yang sama dan alasan logika film terfiksasi tidak dapat diterapkan pada metode sel hidup, lihat atlas pewarnaan mikroskopi.

Eksisi pita dapat dilakukan untuk agarosa preparatif dan oligo PAGE yang dilokalisasi dengan warna biru, asalkan varian fiksasi permanen dihindari. Electroelution setelah penghilangan warna secara kimiawi masuk akal untuk pengikat reversibel, tetapi data yield terkontrol yang spesifik untuk metilen biru masih terbatas. Lakukan desalting atau presipitasi setelah elusi.

Kegagalan yang berulang

Pita gel yang samar biasanya berarti massa terlalu sedikit untuk pewarna kolorimetrik, terutama untuk target RNA atau untai tunggal pendek. Muat lebih banyak, gunakan pewarna segar, perpanjang waktu pewarnaan sebelum menaikkan konsentrasi, dan hentikan penghilangan warna lebih awal. Gel biru pekat tanpa kontras biasanya berarti pewarnaan berlebihan atau terlalu sedikit penggantian air. Pita PAGE yang memudar merupakan kimia yang memang diharapkan, bukan kegagalan pewarnaan. Foto dengan cepat. Latar belakang membran yang tidak merata menunjukkan kemungkinan lipatan, gelembung, sidik jari, pengadukan yang tidak merata, atau transfer yang tidak merata. Jangan menafsirkannya sebagai pemuatan yang tidak sama tanpa kontrol hibridisasi. Pola ribosomal yang melebar dan lemah dapat berarti degradasi, tetapi juga dapat disebabkan oleh transfer yang tidak lengkap, total RNA yang terlalu sedikit (lajur tipikal membawa beberapa hingga puluhan micrograms), atau penghilangan warna berlebihan. Pewarna melaporkan RNA ribosomal yang melimpah. Pewarna tidak melaporkan transkrip tertentu. Tugas tersebut dilakukan oleh probe.

Keselamatan dan penanganan tanpa klaim berlebihan

Metilen biru lebih sederhana untuk ditangani dibandingkan ethidium bromide, tetapi bukan berarti tidak berbahaya. Lembar data keselamatan MilliporeSigma terkini mengklasifikasikan pewarna ini sebagai acute oral toxicity Category 4, berbahaya jika tertelan, dengan pembuangan melalui jalur limbah yang disetujui sesuai SDS metilen biru Sigma-Aldrich. Ethidium bromide memiliki peringatan genotoksisitas yang lebih kuat, termasuk dugaan efek pada germ cell dalam SDS ethidium bromide Sigma-Aldrich, dan gel serta larutannya umumnya dipisahkan sebagai limbah kimia berbahaya sebagaimana disebutkan dalam panduan pewarna asam nukleat Thermo Fisher. Ikuti SDS dan aturan institusi untuk keduanya. Simpan pewarna kering dalam keadaan tertutup rapat dan tetap kering, gunakan ulang larutan pewarna kerja hanya jika diizinkan oleh protokol, simpan membran yang telah diwarnai dalam keadaan kering di antara lembar filter, dan foto gel sebelum pita berdifusi.

Ingat kalimat praktis di meja laboratorium. Gel menguji visibilitas pada muatan tinggi di bawah cahaya putih. Membran menguji transfer dan pemuatan sebelum probe melakukan pekerjaan yang sensitif. Satu pewarna dapat digunakan untuk keduanya, dengan sensitivitas sedang, pengikatan reversibel, dan urutan operasi yang ketat. :::