Metilen biru dalam penelitian zebrafish: aditif pemeliharaan dan pengganggu eksperimen

Air telur zebrafish sering kali berwarna biru samar, dan hampir tidak ada yang menuliskan alasannya. Pewarna tersebut adalah metilen biru, yang ditambahkan untuk melawan jamur, dan sebagian besar protokol memperlakukannya sebagai latar belakang. Latar belakang adalah konsep yang keliru di sini. Konsep yang lebih tepat adalah faktor eksperimen yang tidak tercatat: sesuatu yang ada dalam wadah yang diberi perlakuan dan tidak ada dalam kontrol, aktif secara farmakologis pada konsentrasi yang digunakan, serta mampu mengubah titik akhir yang justru diukur oleh eksperimen.

Perbedaan tersebut menjadi dasar untuk seluruh pembahasan berikut. Pemeliharaan antijamur rutin adalah satu pertanyaan. Apakah aditif tersebut netral terhadap pengujian Anda adalah pertanyaan yang berbeda. Literatur zebrafish terbaru menjawab pertanyaan pertama dengan meyakinkan dan pertanyaan kedua dengan tidak nyaman.

Apa yang sebenarnya ditetapkan oleh pedoman

Tidak ada satu standar tunggal, dan hal tersebut merupakan bagian dari masalahnya. Pedoman Canadian Council on Animal Care mengizinkan 0,5 mg/L, atau 0,00005%, dalam larutan transportasi telur dan larva untuk mengurangi pertumbuhan jamur. Pedoman laboratorium hewan Eropa menjelaskan embrio yang dipelihara dalam medium yang sering mengandung 0,00005% yang sama. Resep E3 Cold Spring Harbor menetapkan dua kali lipat jumlah tersebut, yaitu 1 mg/L atau 0,0001%, sebagai bahan resep. Berlawanan dengan hal ini terdapat sebuah penghilangan yang mencolok: pedoman uji toksisitas embrio ikan OECD menetapkan air pengenceran yang direkonstitusi dan bahan kimia uji, tanpa rekomendasi metilen biru baik dalam versi 2013 maupun revisi berikutnya. Jadi, satu laboratorium memelihara embrio zebrafish dengan metilen biru dalam air biru sejak jam-jam pertama kehidupan, laboratorium lain menjalankan uji embrio regulasi dalam air jernih, dan keduanya menyebut mediumnya normal. Siapa pun yang membandingkan hasil antar laboratorium, atau menggabungkan kontrol historis, mewarisi ketidakkonsistenan tersebut.

Untuk konteks konsentrasi, 0,00005% adalah sekitar 1,56 mikromolar dan 0,0001% sekitar 3,13 mikromolar. Angka-angka ini rendah, dan mudah untuk menganggapnya terlalu rendah untuk memberikan efek. Studi-studi berikut menguji asumsi tersebut, tepat pada konsentrasi tersebut.

Pembaca yang berasal dari pemeliharaan ikan, bukan laboratorium, menemukan molekul yang sama dalam konteks berbeda, yang dibahas dalam panduan akuarium tentang metilen biru. Kimianya sama; pembahasan tentang bagaimana pewarna ini memindahkan elektron melalui sel menjelaskan mengapa senyawa aktif redoks terus muncul dalam penelitian metabolisme. Pembahasan berikut secara khusus membahas air telur zebrafish dengan metilen biru.

Metabolisme: efek berubah arah sesuai tahap

Studi paling informatif mengekspos zebrafish yang berkembang normal sejak hari pertama kehidupan hingga 5 hari setelah pembuahan dan mengukur metabolisme oksidatif pada setiap tahap, sebagaimana dijelaskan dalam laporan yang dipublikasikan tentang eksperimen metabolisme embrio. Polanya perlu dinyatakan dengan hati-hati karena arahnya berbalik.

Pada 1 hari setelah pembuahan, konsumsi oksigen basal meningkat pada embrio yang terpapar pada kedua konsentrasi pemeliharaan. Pada hari ke-2, potensi membran mitokondria pada lapisan permukaan larva meningkat pada paparan 0,00005%, 0,0001%, dan 0,0003%. Pada hari ke-4 hingga ke-5, setelah menetas, arahnya berubah: pengeluaran energi oksidatif menurun, baik paparan berlangsung terus sejak pembuahan maupun secara akut hanya dari hari ke-3 hingga hari ke-4. Secara paralel, transkrip untuk subunit kompleks respirasi mitokondria menurun pada hari ke-1 dan ke-4, bersama dengan transkrip yang berkaitan dengan steroidogenesis dan glukoneogenesis.

Dua pengamatan tambahan memperjelas gambaran tersebut. Penetasan terjadi sedikit lebih awal pada konsentrasi pemeliharaan yang lebih tinggi, dengan embrio yang terpapar berada di depan pada hari ke-2 dan kontrol menyusul pada hari ke-3. Dan sumbu stres itu sendiri tampak tetap berfungsi: ketika larva berusia 5 hari diberi pemicu stres berupa pusaran, kortisol seluruh tubuh meningkat secara normal pada kedua kelompok. Jadi, pewarna tersebut bukan racun perkembangan umum pada dosis ini, dan tidak meratakan setiap respons fisiologis. Pewarna ini mengubah metabolisme energi berdasarkan tahap, meningkat sebelum menetas dan menurun setelahnya.

Perilaku: mengapa dua studi berbeda pendapat, dan mengapa keduanya dapat benar

Literatur perilaku tampak bertentangan sampai desain paparan ditempatkan berdampingan. Satu studi keamanan perkembangan dan perilaku mengekspos embrio sejak sekitar 6 jam setelah pembuahan hingga konsentrasi 10 mikromolar, memperbarui larutan setiap hari hingga hari ke-4, kemudian memindahkan larva ke medium tanpa pewarna selama hari ke-5 dan ke-6 serta menguji pergerakan dalam uji terang-gelap pada hari ke-6. Hasilnya: tidak ada efek signifikan terhadap kematian, penetasan, atau morfologi, dan tidak ada efek perlakuan terhadap pergerakan. Penulis secara wajar merekomendasikan 10 mikromolar sebagai batas atas dalam kondisi mereka.

Kelompok kedua, dengan sebagian penulis yang sama dengan studi metabolisme, menjalankan paparan sebagaimana pemeliharaan sebenarnya berlangsung: pewarna ada sejak 2 hingga 3 jam setelah pembuahan dengan pembaruan sebagian setiap hari, dan perilaku diukur ketika paparan masih berlangsung atau baru saja terjadi. Pada konsentrasi rutin yang sama, larva menunjukkan penurunan pergerakan dalam uji 24 jam, dapat direplikasi pada berbagai galur dan laboratorium, dan studi penggangguan perilaku menghubungkan efek tersebut dengan jalur serotonergik, sesuai dengan penghambatan monoamine oxidase yang telah diketahui dari pewarna tersebut. Yang paling penting, medium embrio yang mengandung metilen biru menutupi respons pergerakan yang diharapkan terhadap SSRI fluoxetine. Dengan demikian, uji penyaringan yang dijalankan dalam air biru dapat melewatkan efek obat yang akan terlihat dalam air jernih.

Tidak ada kontradiksi nyata. Suatu senyawa dapat tidak menunjukkan efek yang terdeteksi dua hari setelah pencucian dalam satu pengujian dan tetap aktif ketika masih ada dalam pengujian lain. Interpretasi praktisnya adalah bahwa hasil nol setelah pencucian hanya menetapkan batas konsentrasi atas, bukan klaim netralitas, sementara hasil positif menggambarkan risiko yang penting: paparan aktif selama periode pengukuran, dalam konfigurasi yang digunakan sebagian besar laboratorium.

Pewarna redoks dalam pengujian redoks

Satu jebakan lain perlu mendapat paragraf tersendiri karena hal ini merusak instrumen pengukuran, bukan hewannya. Uji pengeluaran energi Alamar Blue sendiri merupakan kimia redoks: resazurin direduksi menjadi resorufin fluoresen. Metilen biru juga merupakan kimia redoks. Dalam kontrol bebas sel, kedua konsentrasi pemeliharaan sedikit tetapi secara signifikan menurunkan fluoresensi Alamar Blue setelah 24 jam. Dalam eksperimen hewan, embrio yang terpapar dicuci setidaknya tiga kali dalam medium bebas pewarna sebelum pengujian, dan efek biologis pada larva yang telah menetas melebihi gangguan bebas sel. Jadi, kedua hal tersebut benar: hewan yang telah dicuci membawa efek metabolik nyata, dan pewarna yang tidak dicuci menambahkan artefak kimia langsung di atasnya. Kontrol harus memisahkan keduanya, atau tidak satu pun angka tersebut memiliki arti. Panduan umum tentang membaca hasil pengujian berbasis pewarna berlaku dengan kekuatan khusus di sini.

Linimasa tahap perkembangan

Aset asli untuk artikel ini. Konsentrasi adalah dua nilai standar pemeliharaan, 0,00005% dan 0,0001%, kecuali disebutkan lain.

Pola yang perlu diingat adalah peningkatan awal dan penurunan berikutnya pada titik akhir metabolik, dengan efek perilaku yang muncul selama paparan dan tidak terdeteksi setelah eliminasi pada satu pengujian yang mengujinya.

Daftar periksa desain kontrol

Aset asli kedua. Gunakan ketika protokol zebrafish dengan metilen biru bersinggungan dengan eksperimen.

1. Laporkan pewarna sebagai reagen, bukan sebagai air. Nyatakan konsentrasi dalam persen dan mikromolar, waktu mulai dan berhenti dalam jam atau hari setelah pembuahan, jadwal pembaruan, serta interval pencucian sebelum setiap pengukuran.
2. Sesuaikan kontrol dengan pertanyaan penelitian. Studi tentang bahan kimia uji memerlukan kontrol tanpa pewarna; studi tentang pemeliharaan memerlukan perbandingan tanpa pewarna versus dengan pewarna dengan hasil antijamur dicatat, karena tidak satu pun studi yang dikutip mengukur efektivitas antijamur.
3. Cuci sebelum pengujian redoks, lalu verifikasi. Bilas setidaknya tiga kali dalam medium bebas pewarna dan jalankan kontrol bebas sel berisi pewarna plus reagen secara bersamaan, karena pewarna secara langsung menurunkan sinyal Alamar Blue.
4. Perlakukan perilaku dan titik akhir monoamin sebagai risiko tinggi. Studi pergerakan, respons kejut, perilaku mirip kecemasan, antidepresan, dan penghambatan MAO harus menghindari pewarna selama pengukuran atau menunjukkan netralitas spesifik titik akhir; pencucian selama satu hingga dua hari menghilangkan satu efek pergerakan tetapi belum terbukti untuk paradigma lain.
5. Perlakukan titik akhir metabolik dan mitokondria sebagai risiko tinggi pada setiap tahap. Konsumsi oksigen, pengeluaran energi, potensi membran, dan transkrip rantai respirasi berubah pada konsentrasi pemeliharaan, dengan arah berlawanan sebelum dan sesudah menetas.
6. Jangan memindahkan asumsi netralitas antar desain. Hasil nol setelah pencucian tidak mencakup paparan berkelanjutan; hasil nol pada morfologi tidak mencakup metabolisme atau interaksi obat; hasil pada satu galur, suhu, atau durasi pengujian tidak mencakup yang lain.
7. Nyatakan pedoman yang Anda ikuti dan alternatifnya. Sebutkan konsentrasi CCAC, Eropa, atau Cold Spring Harbor secara eksplisit, dan catat bahwa uji embrio OECD tidak mencantumkan pewarna tersebut, sehingga pembaca dapat menempatkan hewan Anda dalam konteks yang tepat.

Tidak satu pun dari hal ini berargumen menentang penggunaan pewarna untuk menjaga telur tetap hidup. Hal ini berargumen menentang membiarkan pilihan pemeliharaan masuk ke dalam data tanpa pemeriksaan. Warna biru dalam wadah adalah sebuah molekul dengan farmakologi, dan eksperimen yang paling mungkin terdistorsi adalah tepat pada penyaringan metabolik dan neuroperilaku berkapasitas tinggi yang menjadikan zebrafish muda sebagai pilihan populer. Catat, kendalikan, hilangkan sebelum pengukuran, dan periksa pengujian yang mungkin diam-diam dipengaruhinya.