Metilen biru dalam uji laboratorium G6PD: apa yang sebenarnya dilakukan pewarna ini

Seorang mahasiswa mengamati dua tabung setelah inkubasi. Salah satunya telah berubah menjadi warna yang diharapkan. Yang lain belum. Mahasiswa tersebut menyimpulkan bahwa pasien kedua mengalami defisiensi glucose-6-phosphate dehydrogenase. Kesimpulan itu mungkin benar, tetapi penalarannya melewatkan konsep yang membuat pengujian ini bekerja. Tidak ada sesuatu pun di dalam tabung yang mengukur enzim secara langsung. Tabung tersebut mengukur apa yang dihasilkan enzim, dengan menggunakan metilen biru sebagai perantara.

Setelah sifat tidak langsung ini dipahami, prosedur, kontrol, dan daftar panjang hasil palsu tidak lagi tampak sewenang-wenang.

Jawaban singkat

Metilen biru dalam pengujian G6PD adalah indikator redoks. Enzim G6PD menghasilkan NADPH, dan sistem yang bergantung pada NADPH mereduksi metilen biru berwarna biru menjadi bentuk leuko yang tidak berwarna (atau menggunakannya untuk memindahkan elektron). Aktivitas enzim normal menghasilkan reduksi yang efisien. Aktivitas yang rendah menghasilkan reduksi yang lambat atau tidak lengkap. Itulah keseluruhan sinyalnya.

Dua metode historis menggunakan pewarna yang sama tetapi memiliki titik akhir yang berbeda. Pisahkan keduanya dan sebagian besar kebingungan akan hilang.

Dua uji, satu pewarna, titik akhir berbeda

Yang pertama adalah uji reduksi metilen biru langsung, yang dijelaskan oleh Sass dan rekan-rekannya dan kemudian dievaluasi oleh Gibbs. Di sini, titik akhirnya adalah pewarna itu sendiri: metilen biru teroksidasi yang berwarna biru direduksi menuju leucomethylene blue yang tidak berwarna, dan laju perubahan tersebut mencerminkan kapasitas pembentukan NADPH. Makalah skrining utama diindeks di PubMed di bawah Sass et al. (1966).

Yang kedua adalah uji reduksi methemoglobin Brewer. Sodium nitrite terlebih dahulu mengoksidasi hemoglobin menjadi methemoglobin berwarna cokelat. Metilen biru kemudian bertindak sebagai mediator transfer elektron: metilen biru tereduksi meneruskan ekuivalen pereduksi ke methemoglobin, mengubahnya kembali menjadi hemoglobin merah. Karena itu, titik akhir yang terlihat adalah cokelat versus merah, bukan biru versus tidak berwarna. Metode aslinya diterbitkan dalam Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960).

Menyebut uji Brewer sebagai uji dekolorisasi pewarna tidak tepat secara kimia. Pewarna mengalami siklus; hemoglobinlah yang berubah warna. Diagram di bawah ini menelusuri kedua jalur tersebut.

Reaksi yang mendasarinya

G6PD mengatalisis tahap oksidatif pertama dalam jalur pentosa fosfat:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Sel darah merah matang sangat bergantung pada jalur ini untuk NADPH, sebagaimana ditinjau dalam Blood oleh Luzzatto dan rekan-rekannya (2020). NADPH mempertahankan glutathione dalam keadaan tereduksi dan melindungi sel dari kerusakan oksidatif. Metilen biru masuk ke dalam sistem ini sebagai akseptor elektron. G6PD yang memadai menghasilkan NADPH yang memadai, yang menghasilkan reduksi efisien. G6PD yang rendah memutus rantai pada mata rantai pertamanya.

Anggap pewarna sebagai pengukur bahan bakar, bukan mesinnya. Pewarna melaporkan pasokan NADPH. Faktor lain apa pun yang mengubah pasokan tersebut, atau pembacaannya, dapat menggeser hasil tanpa adanya perubahan pada gen.

Cara menjalankan prosedur tipe Brewer

Resep reagen telah bervariasi selama beberapa dekade, sehingga deskripsi untuk tujuan pembelajaran tidak boleh dianggap sebagai protokol klinis. Setiap laboratorium mengikuti prosedur operasi standar tervalidasi miliknya sendiri. Dengan catatan tersebut, susunan tabung klasik berjalan sebagai berikut, dalam bentuk yang didokumentasikan menggunakan tiga tabung dan inkubasi 3 jam dalam implementasi yang telah dipublikasikan ini:

1. Tabung pasien: darah utuh ditambah glucose, sodium nitrite, dan metilen biru. Nitrite membentuk methemoglobin, glucose memasok metabolisme sel darah merah, dan pewarna menyediakan mekanisme pemindahan yang bergantung pada NADPH.
2. Kontrol teroksidasi: darah ditambah nitrite dan glucose tetapi tanpa metilen biru. Tabung ini menunjukkan titik akhir methemoglobin cokelat, yaitu pola defisiensi.
3. Kontrol hemoglobin: darah ditambah air. Tabung ini menunjukkan titik akhir hemoglobin merah, yaitu pola normal.
4. Inkubasi semua tabung mendekati 37 C, biasanya selama 3 jam, dengan pencampuran lembut.
5. Encerkan sebagian kecil dari setiap tabung ke dalam air suling untuk melisis sel dan membuat perbandingan warna lebih mudah dibaca.
6. Bandingkan tabung pasien dengan kedua kontrol. Perubahan kembali menuju merah menunjukkan kapasitas reduksi yang substansial. Warna yang tetap cenderung cokelat menunjukkan kemungkinan defisiensi berat.

Salah satu formulasi historis menggunakan sekitar 1 mL darah dengan reagen pada kisaran 180 mM sodium nitrite, 280 mM dextrose, dan 0.4 mM metilen biru. Perlakukan angka-angka tersebut sebagai contoh dari literatur, bukan sebagai spesifikasi universal.

Membaca hasil

Skrining kualitatif memberikan diskriminasi terbaik di sekitar 30 hingga 40 persen aktivitas normal, sebagaimana dibahas dalam tinjauan Malaria Journal tentang kesenjangan deteksi G6PD ini. Karena itu, hasil skrining normal berarti uji tersebut tidak mendeteksi defisiensi berat. Hasil tersebut tidak memastikan bahwa aktivitas sepenuhnya normal.

Mengapa skrining dapat menyesatkan

Retikulositosis setelah hemolisis adalah penyebab klasik hasil normal palsu. Sel darah merah muda dan retikulosit memiliki lebih banyak G6PD dibandingkan sel yang lebih tua. Selama episode hemolitik akut, sel tertua dengan defisiensi paling berat mungkin sudah hancur, sehingga menyisakan populasi muda yang aktivitasnya tampak normal dalam pengujian. Biologi yang sama juga dapat menyesatkan uji kuantitatif, bukan hanya skrining berbasis pewarna.

Transfusi baru-baru ini dapat menutupi defisiensi karena sel darah merah donor menyumbangkan enzimnya sendiri ke dalam spesimen. Mayo Clinic Laboratories mencantumkan transfusi sebagai salah satu penyebab hasil enzim yang tidak dapat diandalkan, bersama dengan retikulositosis dan interferensi leukosit.

Perempuan heterozigot merupakan kasus yang paling sulit. Inaktivasi kromosom X secara acak menghasilkan campuran sel darah merah normal dan defisien, dan aktivitas keseluruhan dapat berada di mana saja mulai dari defisiensi berat hingga tampak normal. Skrining kualitatif sering tidak mendeteksi fenotipe intermediat. Dokumentasi WHO tentang pengujian G6PD membahas keterbatasan ini secara rinci.

Usia spesimen, suhu penyimpanan, subjektivitas titik akhir visual, hematokrit, dan kualitas reagen menambahkan variasi analitis di atas efek biologis tersebut.

Skrining bukan diagnosis

Hasil skrining yang menunjukkan defisiensi, intermediat, atau tidak sesuai dengan kondisi klinis memerlukan uji enzim G6PD kuantitatif. WHO menganggap spektrofotometri kuantitatif dengan suhu terkontrol sebagai pendekatan rujukan. Dalam uji tersebut, hemolisat sel darah merah diberi glucose-6-phosphate dan NADP+, lalu NADPH yang terbentuk dipantau melalui peningkatan absorbansi pada 340 nm. Laju perubahan sebanding dengan aktivitas enzim, biasanya dinormalisasi terhadap hemoglobin sebagai unit per gram. Praktik laboratorium klinis saat ini dirangkum dalam entri katalog uji Mayo untuk aktivitas G6PD.

Interpretasi menggunakan rentang rujukan yang telah divalidasi oleh laboratorium, sering kali dinyatakan relatif terhadap aktivitas normal populasi, dengan defisiensi umumnya dibahas di sekitar ambang 30 persen dan aktivitas intermediat berada di atasnya. Profil produk target WHO untuk uji G6PD (2022) menjabarkan kerangka diagnostik tersebut. Jika hemolisis atau transfusi baru-baru ini membuat penentuan fenotipe tidak dapat diandalkan, ulangi pengujian setelah populasi sel darah merah kembali mencapai keseimbangan, dan pengujian molekuler dapat memberikan informasi tambahan tanpa menggantikan pengukuran enzim.

Batasan yang penting dipertahankan

Metilen biru dalam uji ini adalah reagen laboratorium ex vivo. Fakta tersebut merupakan pembahasan yang berbeda dari keamanan pemberian metilen biru kepada pasien, yang dibahas dalam panduan mengenai kontraindikasi metilen biru. Biokimianya menghubungkan keduanya, karena obat tersebut juga bergantung pada reduksi yang bergantung pada NADPH, tetapi pewarna di dalam tabung uji bukanlah dosis di dalam aliran darah. Untuk konteks mengenai perilaku pewarna ini sebagai bahan pewarnaan dalam situasi lain, lihat prinsip pewarnaan metilen biru, dan untuk kelompok kimia tempat senyawa ini termasuk, lihat pewarna redoks di laboratorium.

Skrining menanyakan apakah kapasitas reduksi tampak tetap utuh. Konfirmasi menanyakan berapa banyak enzim yang sebenarnya ada. Pewarna menjawab pertanyaan pertama dengan baik, selama tidak diminta menjawab pertanyaan kedua. :::