Methylene blue dan pensinyalan inflamasi: inflamasom, IL-6, dan STAT3

Misalkan tiga laboratorium melaporkan bahwa senyawa biru yang sama bersifat antiinflamasi. Satu menunjukkan lebih sedikit IL-1beta dari makrofag. Satu menunjukkan lebih sedikit enzim iNOS pada jenis sel yang sama. Satu menunjukkan lebih sedikit IL-6 dalam darah dan lebih sedikit aktivitas STAT3 di otak. Godaannya adalah menggabungkan ketiganya menjadi satu klaim. Penggabungan itu justru menutupi temuan sebenarnya.

Setiap hasil termasuk dalam konsep pensinyalan yang berbeda, dengan pemicu, tahap perakitan, dan hasil pengukurannya sendiri. Methylene blue berinteraksi dengan setiap konsep pada titik yang berbeda. Apakah semua ini memperbaiki suatu luaran kesehatan merupakan pertanyaan terpisah, yang dibahas dalam ikhtisar methylene blue dan inflamasi. Halaman ini tetap berfokus pada jalurnya.

Jalur 1: perakitan inflamasom dan caspase-1

Inflamasom adalah kerangka protein yang dibentuk sesuai kebutuhan di dalam sel mieloid. Komponennya terdiri dari sensor, adaptor yang disebut ASC, dan enzim efektor yang disebut caspase-1. Setelah terbentuk, caspase-1 memotong pro-IL-1beta dan pro-IL-18 menjadi bentuk yang disekresikan dan dapat memicu piroptosis, suatu bentuk kematian sel yang bersifat inflamatorik. Sensor menentukan jenisnya: NLRP3 merespons kristal dan toksin pembentuk pori seperti nigericin dan ATP, NLRC4 merespons flagelin bakteri, AIM2 merespons DNA untai ganda sitosolik, dan jalur nonkanonik merespons lipopolisakarida intraseluler.

Aktivasi memerlukan dua sinyal. Sinyal pertama adalah priming: ligan reseptor Toll-like mendorong transkripsi NLRP3 dan pro-IL-1beta yang bergantung pada NF-kB sehingga komponennya tersedia. Sinyal kedua adalah perakitan: pemicu kedua menyebabkan ASC beroligomerisasi menjadi speck, caspase-1 dipotong menjadi fragmen p20, dan IL-1beta p17 matang dilepaskan. Spesies oksigen reaktif mitokondria dan pengambilan kristal diketahui berkontribusi terhadap sinyal kedua untuk NLRP3.

Studi makrofag tahun 2017 tentang inhibisi luas inflamasom menguji methylene blue pada kedua sinyal. Pada makrofag sumsum tulang tikus yang telah dipriming dengan lipopolisakarida, nigericin, ATP, dan kristal monosodium urat masing-masing menginduksi pelepasan IL-1beta dan caspase-1 serta pembentukan speck ASC, dan methylene blue pada 20 hingga 200 micromolar mengurangi ketiganya secara bergantung dosis tanpa membunuh sel. Flagelin dan Salmonella untuk NLRC4, DNA untai ganda dan Listeria untuk AIM2, serta lipopolisakarida yang ditransfeksikan atau E. coli hidup untuk jalur nonkanonik menunjukkan pola yang sama. Senyawa itu sendiri tidak memicu pelepasan, dan pelat kontrol tidak menunjukkan efek antibakteri, sehingga hasilnya berkaitan dengan respons inang.

Di bagian hulu, tiga intervensi diukur. Superoksida mitokondria yang diinduksi rotenone menurun dengan methylene blue, dan pelepasan IL-1beta yang dipicu rotenone juga menurun. Pengambilan bead fluoresen menurun, konsisten dengan berkurangnya fagositosis sebelum pengenalan kristal. Reporter yang dikendalikan oleh promoter NLRP3 dengan dua situs NF-kB menunjukkan aktivitas lebih rendah dengan methylene blue, sedangkan promoter terpotong tanpa situs tersebut tidak merespons. Dalam tabung bebas sel, methylene blue juga secara langsung menurunkan aktivitas caspase-1 manusia rekombinan. Menambahkan senyawa hanya pada tahap priming atau hanya pada tahap aktivasi tetap mengurangi pelepasan IL-1beta, IL-18, dan caspase-1, sehingga kedua tahap terlibat.

Pengujian pada tikus sesuai dengan selektivitas ini. Dosis lipopolisakarida yang mematikan membunuh kontrol dalam hitungan jam, sedangkan methylene blue meningkatkan kelangsungan hidup; IL-1beta peritoneal menurun tetapi IL-6 dalam cairan yang sama tidak. Dalam model peritonitis Listeria, IL-1beta peritoneal menurun sementara jumlah total sel tidak berubah. Monosit THP-1 manusia berperilaku seperti makrofag tikus pada keempat jenis inflamasom. Hasil terkait inflamasom menjelaskan pematangan IL-1beta dan IL-18, bukan setiap sitokin, yang juga menjadi alasan mengapa bentuk sel imun otak dalam eksperimen mikroglia dan astrosit menjawab pertanyaan yang berbeda dari perakitan kerangka protein.

Jalur 2: transkripsi iNOS melalui pengikatan NF-kB dan STAT1

Inducible nitric oxide synthase, atau iNOS, hampir tidak ada dalam keadaan istirahat dan ditranskripsikan sesuai kebutuhan. Lipopolisakarida mendorongnya terutama melalui degradasi IkB-alpha yang diikuti fosforilasi NF-kB dan masuknya ke nukleus. Interferon-gamma mendorongnya terutama melalui fosforilasi STAT1 oleh Janus kinase yang diikuti masuknya STAT1 ke nukleus. Setiap faktor kemudian berikatan dengan situsnya pada promoter iNOS. Aktivitas enzim dan induksi gen merupakan titik kontrol yang terpisah, dan suatu obat dapat bekerja pada salah satunya atau keduanya.

Studi tahun 2015 tentang induksi iNOS pada makrofag dan tikus endotoksemik menempatkan efek tersebut pada tingkat transkripsi. Pada sel RAW 264.7 dan makrofag primer tikus, 1 micromolar methylene blue yang diberikan 30 menit sebelum lipopolisakarida, interferon-gamma, atau keduanya mengurangi protein dan mRNA iNOS selama 8 hingga 24 jam, dengan kadar nitrit lebih rendah dalam medium dan tanpa penurunan viabilitas. Pada tikus yang diberi 25 mg per kg lipopolisakarida, satu dosis 5 mg per kg satu jam sebelumnya mengurangi protein dan mRNA iNOS di paru-paru, hati, dan jantung.

Detail yang membedakan adalah apa yang tidak berubah. Degradasi IkB-alpha, fosforilasi NF-kB, fosforilasi STAT1, dan akumulasi nuklir kedua faktor tetap utuh. Gangguan terjadi satu langkah kemudian: ekstrak nuklir menunjukkan lebih sedikit pengikatan NF-kB ke elemen DNA-nya setelah lipopolisakarida dan lebih sedikit pengikatan STAT1 setelah interferon-gamma, dan imunopresipitasi kromatin mengonfirmasi lebih sedikit okupansi kedua faktor pada promoter iNOS di dalam sel. Tumor necrosis factor alpha, yang promoternya juga menggunakan NF-kB, ikut menurun. Faktor-faktor tersebut telah diaktifkan dan tiba di nukleus, tetapi berikatan dengan DNA targetnya secara kurang efektif.

Perhatikan perbedaannya dengan jalur 1. Jalur ini berkaitan dengan interaksi faktor dengan DNA, menggunakan STAT1 alih-alih STAT3, dan mengukur mRNA, protein, serta nitrit, bukan speck ASC dan fragmen caspase-1. Peta target methylene blue di berbagai model sel kami memisahkan tingkat transkripsi ini dari pengukuran langsung enzim dan mitokondria.

Jalur 3: IL-6 serum dan aktivasi STAT3 jaringan

IL-6 memberi sinyal melalui keluarga reseptor gp130 ke kaskade Janus kinase hingga STAT3. STAT3 yang terfosforilasi berdimerisasi, masuk ke nukleus, dan mendorong program inflamasi, sementara IL-6 sendiri merupakan target NF-kB, sehingga keduanya membentuk loop umpan balik yang sering disebut sumbu IL-6 ke STAT3. Hasil pengukuran standar adalah IL-6 serum di bagian hulu, rasio STAT3 terfosforilasi terhadap total STAT3, dan enzim efektor seperti iNOS dan COX2 di bagian hilir.

Studi tikus tahun 2023 tentang IL-6 dan STAT3 setelah lipopolisakarida mengukur sumbu tersebut di berbagai kompartemen. Tikus jantan C57BL/6 menerima 1 mg per kg lipopolisakarida setiap hari selama tiga hari, dengan 5 atau 10 mg per kg methylene blue 30 menit setelah setiap dosis. Pada hari ketiga, IL-6 serum lebih rendah pada kedua kelompok methylene blue dibandingkan dengan lipopolisakarida saja, sementara sebagian besar sitokin lain dalam panel tidak berubah dengan perlakuan. Rasio STAT3 terfosforilasi terhadap total STAT3 lebih rendah di korteks, hipokampus, dan kulit telinga, disertai pewarnaan mikroglia Iba-1 yang lebih rendah, iNOS dan COX2 yang lebih rendah, serta penurunan berat badan yang berkurang sebagian.

Dua kehati-hatian penting di sini. IL-6 serum yang lebih rendah bersama fosforilasi STAT3 jaringan yang lebih rendah konsisten dengan modulasi sumbu tersebut, tetapi tidak mengisolasi titik utama yang terkena, karena sitokin hulu yang lebih rendah, pensinyalan reseptor yang lebih rendah, atau perubahan aktivitas fosfatase masing-masing dapat menghasilkan rasio yang sama. Selain itu, berat badan selama tiga hari tantangan akut adalah hasil pengukuran seluruh hewan, bukan skor gejala atau remisi. Hal itu menambahkan konteks di luar hasil blot tanpa mengubah hasil pensinyalan menjadi klaim pengobatan. Kimia terpisah dari penanganan redoks mitokondria berjalan paralel dengan penjelasan sitokin ini dan tidak boleh digabungkan dengannya.

Perbandingan jalur: titik intervensi dan hasil pengukuran

Tabel tersebut mencegah tiga pemindahan kesimpulan yang tidak valid. Hasil speck ASC tidak membuktikan hasil STAT3. Hasil STAT1 pada promoter iNOS tidak membuktikan hasil STAT3, meskipun kedua protein termasuk anggota keluarga STAT. Hasil IL-6 serum tidak membuktikan berkurangnya perakitan inflamasom: dalam eksperimen peritoneal, IL-1beta menurun sementara IL-6 tidak. Setiap baris memerlukan pemicu dan hasil pengukurannya sendiri, sehingga pembacaan studi methylene blue pada sel, hewan, dan klinis harus mencocokkan setiap klaim dengan tingkat yang benar-benar diukur.

Tidak satu pun dari hal ini menetapkan dosis, keamanan, atau manfaat pada manusia. Model lipopolisakarida merupakan pemicu terkontrol untuk menguji suatu mekanisme, bukan replika penyakit kronis, dan pemberian dosis bersamaan dengan pemicu menguji pencegahan perubahan yang diinduksi, bukan pembalikan penyakit yang sudah terbentuk. Pisahkan uraian mekanisme ini dari luaran pasien, dan nilai setiap klaim kesehatan berdasarkan studi pasien yang mendasarinya.