Methylene blue dan ALS: mengapa hasil berbeda antar model eksperimental

Cari methylene blue ALS dan Anda akan menemukan dua klaim yang tampaknya saling bertentangan. Satu menyatakan bahwa pewarna biru tersebut melindungi neuron dalam model ALS. Yang lain menyatakan bahwa zat tersebut tidak memberikan efek pada tikus ALS. Kedua klaim mengutip makalah ilmiah nyata, dan keduanya layak diperhatikan dengan serius. Pertentangan itu hilang setelah konsep di balik masing-masing eksperimen dinyatakan dengan jelas: model menentukan batas klaim.

Hasil pada cacing adalah klaim tentang cacing. Hasil pada ikan larva adalah klaim tentang ikan larva. Keduanya bukan klaim tentang pasien sampai perjalanan penyakit pada mamalia menunjukkan hal tersebut. Artikel ini membandingkan dua makalah yang paling sering dikutip secara berdampingan agar Anda dapat melihat mengapa jawabannya berbeda.

Dua eksperimen dalam satu tabel

Biarkan tabel ini tetap tersedia saat Anda membaca. Setiap perbedaan penting antara kedua studi tercantum di sini.

Genetikanya berbeda, spesiesnya berbeda, rute pemberiannya berbeda, waktunya berbeda, dan endpoint-nya berbeda. Genotipe hanya satu dari lima perbedaan, sehingga pasangan studi ini tidak dapat membuktikan bahwa methylene blue bekerja secara selektif pada satu jalur ALS tertentu. Yang dibuktikannya lebih sempit tetapi tetap berguna: pemulihan yang kuat dengan paparan langsung sejak dini pada model sederhana tidak berlanjut menjadi manfaat dalam perjalanan penyakit mamalia dengan pemberian oral kronis.

Hasil positif: apa yang ditunjukkan studi pada cacing dan ikan

Studi cacing dan ikan tahun 2012 mengekspresikan mutan human TDP-43 atau FUS pada neuron motorik cacing dan menyuntikkan mRNA human mutan ke dalam embrio ikan. Ini adalah model proteotoksisitas. Model tersebut mereproduksi efek toksik protein mutan terhadap gerakan dan bentuk neuron selama beberapa hari, bukan seluruh perjalanan ALS pada manusia dewasa selama bertahun-tahun.

Perawatan dimulai sangat dini. Cacing tumbuh pada agar yang mengandung methylene blue sejak menetas. Embrio ikan ditempatkan dalam larutan obat semalaman mulai 24 jam setelah fertilisasi, dengan perilaku diuji sekitar dua hari kemudian. Tidak ada sawar darah otak yang berada di antara obat dan neuron seperti pada mamalia, dan tidak ada kadar obat dalam plasma atau otak yang diukur.

Dalam kondisi tersebut, efeknya besar dan konsisten. Baik 6 maupun 60 μM mengurangi paralisis yang bergantung pada usia pada cacing TDP-43 dan FUS. Pada hari ke-12 masa dewasa, sekitar 80 persen cacing TDP-43 yang tidak diobati mengalami paralisis dibandingkan sekitar 10 persen cacing yang diberi perlakuan sejak menetas. Uji sinaptik menunjukkan arah yang sama: cacing TDP-43 sangat sensitif terhadap aldicarb, obat yang digunakan untuk menguji transmisi neuromuskular, dan methylene blue menggeser respons kembali mendekati normal. Jumlah juluran neuron motorik yang mengalami degenerasi menurun, dengan efek paling jelas pada 60 μM. Pada ikan, renang yang dipicu sentuhan membaik secara substansial dan akson motorik yang memendek tumbuh kembali mendekati panjang normal pada 30 atau 60 μM, meskipun pemulihannya bersifat parsial, bukan lengkap.

Data stres oksidatif sesuai dengan interpretasi antioksidan. Cacing dan ikan mutan menunjukkan peningkatan indikator spesies oksigen reaktif yang menurun setelah perlakuan, dan cacing normal yang diberi methylene blue bertahan jauh lebih lama terhadap tantangan pro-oksidan dibandingkan cacing yang tidak diobati. Namun, ada dua batasan penting. Kadar total protein mutan TDP-43 dan FUS tidak menurun, dan studi tersebut tidak secara langsung mengukur agregat protein, sehingga hasilnya menunjukkan pemulihan fungsi tanpa membuktikan pembersihan agregat. Siapa pun yang mengikuti bagaimana hipotesis redoks dan mitokondria biasanya dirumuskan sebaiknya menganggap mekanisme tersebut didukung, tetapi belum dipastikan.

Waktu pemberian merupakan detail yang paling informatif. Ketika para penulis menunggu hingga hari ke-5 masa dewasa untuk memulai perawatan, tingkat paralisis pada hari ke-12 sekitar 55 persen, dibandingkan sekitar 10 persen bila perawatan dimulai sejak menetas. Obat yang sama, cacing yang sama, mutasi yang sama, tetapi efeknya jauh lebih kecil. Paparan profilaksis sejak dini menyumbang sebagian besar manfaat yang tampak.

Hasil nol: apa yang ditunjukkan studi tikus SOD1

Studi tikus tahun 2011 mengajukan pertanyaan yang lebih sulit dalam sistem yang lebih ketat. Tikus congenic SOD1 G93A berkembang dari tremor tungkai belakang melalui gangguan berjalan dan hilangnya refleks membalikkan tubuh hingga endpoint terminal yang telah ditentukan. Perawatan dimulai sebelum gejala pada hari ke-45 dan dilanjutkan setiap hari, dengan pengamat menilai kondisi neurologis pada skala 0 hingga 6. Ini adalah eksperimen yang mencakup seluruh perjalanan penyakit, sehingga lebih dekat dengan hal yang relevan bagi pasien dibandingkan kurva paralisis apa pun pada cacing.

Jawaban utamanya adalah hasil nol. Onset keseluruhan terjadi pada 121 hari pada kontrol dibandingkan 124 hari dengan methylene blue, perbedaan yang tidak signifikan. Kelangsungan hidup hingga stadium akhir adalah 167 hari dibandingkan 170 hari, juga tidak signifikan. Beberapa analisis sekunder mendukung perlakuan: betina menunjukkan penundaan onset sekitar 7 hari, dan hewan yang diobati menghabiskan waktu agak lebih lama pada stadium yang lebih ringan dan lebih sedikit pada stadium berat. Dengan subkelompok berdasarkan jenis kelamin yang kecil dan banyak perbandingan antarstadium, temuan tersebut lebih tepat dibaca sebagai pembangkit hipotesis daripada sebagai bukti. Tidak ada penghitungan neuron, tidak ada uji agregasi SOD1, dan tidak ada penanda oksidatif atau inflamasi yang diukur, sehingga studi ini juga tidak dapat menentukan apakah obat mencapai targetnya tetapi gagal, atau tidak pernah memengaruhi target pada dosis ini. Hanya satu dosis yang diuji.

Para penulis sendiri menyoroti batasan terdalam, yang berlaku ke dua arah. High copy SOD1 G93A memodelkan penyakit SOD1 toksik dengan baik, tetapi penyakit SOD1 hanya mencakup sebagian kecil ALS familial dan memiliki biologi yang berbeda dari sebagian besar penyakit sporadis. Mereka menyarankan pengujian ulang kandidat pada model mamalia berbasis TDP-43. Saran itu kemudian menjadi lebih rumit, karena para penulis studi cacing dan ikan mencatat bahwa studi terpisah pada tikus TDP-43 dengan methylene blue juga gagal memperbaiki hasil motorik. Dengan demikian, suatu senyawa dapat terlihat kuat dalam satu sistem TDP-43 dan tidak menunjukkan efek dalam sistem TDP-43 lainnya. Sistem sama pentingnya dengan gen.

Mengapa perbaikan pada cacing atau ikan tidak dapat membuktikan manfaat pada pasien

Anggap setiap model menjawab pertanyaan yang berbeda.

Pertama, biologinya berbeda. TDP-43 dan FUS adalah protein pengikat asam nukleat dengan interaksi genetik yang sama dalam sistem sederhana ini, sedangkan toksisitas SOD1 berlangsung melalui mekanisme proksimal yang sebagian berbeda. Obat yang mengurangi satu bentuk stres proteotoksik belum tentu mengurangi yang lain, dan keberhasilan terhadap overekspresi embrionik belum tentu memprediksi keberhasilan terhadap neurodegenerasi dewasa yang lambat dengan inflamasi, keterlibatan glia, dan penurunan sistemik.

Kedua, paparannya berbeda. Paparan terus-menerus melalui rendaman pada konsentrasi mikromolar tidak sama dengan pemberian oral. Absorpsi usus, metabolisme lintas pertama, pengikatan protein plasma, penetrasi otak, dan eliminasi semuanya berada di antara dosis yang ditelan dan neuron motorik spinal. Tidak ada studi yang mengukur kadar obat dalam sistem saraf, sehingga tidak satu pun dapat menghubungkan konsentrasinya dengan studi yang lain.

Ketiga, waktunya berbeda. Manfaat pada cacing dan ikan sangat bergantung pada pemberian sebelum patologi terakumulasi. Perawatan pada tikus juga dimulai sebelum gejala, yang merupakan kekuatan desain, tetapi perawatan pada manusia hampir selalu akan dimulai setelah munculnya gejala, yang lebih terlambat lagi. Sinyal profilaksis dalam uji embrio dua hari adalah titik awal untuk penelitian, bukan model penggunaan klinis.

Keempat, endpoint-nya berbeda. Paralisis pada 12 hari, sensitivitas terhadap aldicarb, panjang akson dalam mikrometer, dan jarak renang adalah fenotipe proksimal. Onset dan kelangsungan hidup pada mamalia mengintegrasikan setiap proses kompensasi dan komplikasi di seluruh tubuh. Obat sering mengubah indikator proksimal tanpa mengubah kelangsungan hidup, dan itulah alasan endpoint time to event pada mamalia digunakan.

Pembaca yang menginginkan daftar periksa untuk menilai headline berikutnya dapat mengambilnya dari cara membaca studi praklinis: tanyakan spesiesnya, transgennya, dosis dan rute pemberiannya, apakah kadar obat diukur, kapan perawatan dimulai relatif terhadap patologi, apakah endpoint merupakan fenotipe jangka pendek atau perjalanan penyakit, dan apakah efek tersebut direplikasi di laboratorium kedua. Basis bukti manusia yang lebih luas untuk methylene blue tetap menjadi tempat untuk memeriksa apakah sinyal awal tersebut berkembang menjadi data klinis.

Apa artinya bagi pasien dan keluarga

Tidak ada protokol methylene blue yang mapan untuk ALS yang dapat diturunkan dari makalah-makalah ini. Studi positif mendukung penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme oksidatif dan sinaptik dalam biologi TDP-43 dan FUS. Studi dengan hasil nol mengurangi dasar untuk mengharapkan modifikasi penyakit dari pemberian oral kronis pada tingkat paparan ini dalam penyakit tipe SOD1. Secara bersama-sama, kedua studi tersebut menggambarkan ketidakkonsistenan antar model, bukan rekomendasi perawatan.

Keamanan perlu dinilai dengan kerangka yang sama hati-hatinya dengan efikasi. Studi ALS pada tikus tidak memberikan informasi tentang dosis yang aman bagi manusia, dan methylene blue memiliki risiko nyata berupa hemolisis pada defisiensi G6PD serta toksisitas serotonin bila dikombinasikan dengan obat serotonergik. Dugaan defisiensi G6PD, penggunaan antidepresan saat ini, dan perubahan obat apa pun yang direncanakan perlu dibahas dengan tenaga klinis, begitu pula peninjauan data keamanan umum methylene blue sebelum seseorang bertindak berdasarkan headline penelitian laboratorium.

Kesimpulannya dapat dirangkum dalam satu kalimat. Methylene blue menghasilkan pemulihan kuat dengan paparan dini pada fenotipe cacing TDP-43 dan FUS serta ikan larva, tetapi pada dasarnya tidak memberikan manfaat terhadap onset atau kelangsungan hidup dalam studi tikus SOD1 dengan pemberian oral kronis, sehingga interpretasi yang tepat adalah bahwa bukti bergantung pada model dan tidak mendukung penggunaan pada pasien.