Artikel
Membaca E. coli dan tampilan koloni lain pada agar EMB
Seorang mahasiswa menggoreskan sampel tak dikenal pada eosin methylene blue agar, menginkubasinya semalaman, lalu kembali menemukan cawan dengan koloni gelap berkilau hijau. Catatan di buku laboratorium berbunyi "E. coli, dikonfirmasi." Catatan tersebut menyatakan lebih dari yang dapat didukung oleh cawan. Cawan menunjukkan fenotipe pertumbuhan dan fermentasi dalam kondisi tertentu. Identitas spesies adalah klaim terpisah yang membutuhkan bukti terpisah.
Panduan ini memperlakukan hasil agar EMB sebagai tugas interpretasi. Panduan ini menjelaskan gagasan dasarnya, membahas atlas cawan ilustratif dengan kontrol, dan menyebutkan kasus ketika gambaran buku teks dapat menyesatkan.
Gagasan di balik cawan
Agar EMB bersifat selektif sekaligus diferensial. Pewarna eosin Y dan methylene blue menekan banyak organisme Gram positif, sehingga medium mendukung pertumbuhan Gram negatif. Pewarna yang sama bertindak sebagai indikator: ketika suatu organisme memfermentasi gula yang tersedia dan menghasilkan cukup asam lokal, koloni menyerap pewarna secara kuat dan berubah menjadi ungu gelap hingga biru hitam. Dengan produksi asam yang kuat, permukaan koloni dapat menunjukkan iridesensi hijau metalik. Protokol ASM untuk cawan eosin methylene blue agar menjelaskan kombinasi seleksi dan diferensiasi ini serta menyediakan foto referensi untuk pengajaran.
Satu hal penting sebelum membaca hasil: periksa formulasi yang digunakan. Formulasi Holt Harris Teague yang lebih lama mengandung laktosa plus sukrosa, sedangkan Levine EMB hanya mengandung laktosa. Organisme yang memfermentasi sukrosa tetapi tidak laktosa, seperti banyak isolat Serratia marcescens, dapat terlihat berbeda pada dua versi tersebut. Dokumentasi produsen untuk media EMB menyatakan perbedaan formulasi ini secara eksplisit. Catat produsen dan formulasi dalam buku laboratorium bersama hasilnya.
Agar EMB siap pakai yang tidak diinokulasi biasanya berwarna merah cokelat hingga ungu kemerahan, terkadang dengan rona kehijauan atau endapan halus. Warna latar tersebut bukan pertumbuhan. Bandingkan setiap pembacaan dengan cawan tanpa inokulasi atau dasar yang terdokumentasi, dan baca cawan utama setelah sekitar 18 hingga 24 jam inkubasi aerobik pada 35 hingga 37 C kecuali protokol pengajaran menentukan sebaliknya. Inkubasi lebih lama dapat mengubah tampilan fermentasi.
Cara melihat cawan
Gunakan dua jenis cahaya. Pertama periksa cawan dengan cahaya pantulan atau miring dan miringkan cawan: kilau metalik bersifat iridesen dan dapat muncul atau hilang tergantung sudut pandang. Kemudian periksa dengan cahaya transmisi untuk menilai warna koloni dan pusat gelap. Gunakan koloni yang terisolasi dengan baik, karena kepadatan dan koloni di sekitarnya mengubah akumulasi asam lokal dan dapat menekan atau memperkuat warna. Kumpulan gambar ASM menunjukkan hal ini secara langsung: E. coli dalam kultur campuran dapat kehilangan kilau yang diharapkan karena organisme di sekitarnya mengubah lingkungan asam.
Sertakan kontrol jika latihan memungkinkan. Kumpulan pengajaran yang umum adalah E. coli ATCC 25922 untuk fenotipe warna biru hitam dan kilau metalik, nonfermenter seperti Salmonella Typhimurium ATCC 14028 atau Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 untuk fenotipe tak berwarna, dan Gram positif seperti Enterococcus faecalis atau Staphylococcus aureus sebagai kontrol inhibisi, seperti tercantum dalam tabel QC standar untuk media EMB. Jika kontrol positif tidak memiliki kilau, curigai inkubasi, kepadatan, atau formulasi sebelum mencurigai sampel tak dikenal.
Atlas cawan ilustratif
Cawan di bawah ini adalah ilustrasi yang dibuat, bukan foto kultur nyata. Cawan tersebut menunjukkan pola yang harus dicari, bukan warna pasti dari satu strain tertentu. Bandingkan dengan foto referensi ASM dan dengan cawan nyata dari laboratorium pengajaran.
Cawan 1: Escherichia coli pada agar EMB, fermenter laktosa kuat
E. coli pada agar EMB biasanya berwarna ungu gelap hingga biru hitam, sering dengan pusat gelap dan kilau hijau metalik akibat produksi asam yang kuat. Kilau tersebut adalah temuan terkenal yang dicari mahasiswa, tetapi perlakukan sebagai bukti pendukung, bukan definisi. Intensitas kilau bervariasi berdasarkan strain, waktu inkubasi, kepadatan koloni, dan sudut pandang. Tidak adanya kilau tidak menyingkirkan E. coli, dan koloni gelap tanpa kilau dapat menunjukkan beberapa fermenter lain. Ambil koloni yang terisolasi dengan baik untuk pekerjaan lanjutan apa pun, bukan dari area yang padat.
Cawan 2: Klebsiella pneumoniae pada agar EMB, fermenter berlendir
Klebsiella pneumoniae pada agar EMB biasanya membentuk koloni besar, mengilap, berlendir dengan warna merah muda ungu hingga cokelat ungu, sering dengan pusat gelap tetapi biasanya tanpa kilau metalik kuat. Morfologi serupa terjadi pada fermenter terkait seperti Enterobacter. Tekstur berlendir dan ukuran koloni merupakan bagian dari pembacaan: koloni merah muda yang kecil dan datar memiliki bobot interpretasi berbeda dibandingkan koloni besar berbentuk kubah dan berlendir. Seperti E. coli, cawan menunjukkan fenotipe fermentasi, dan penamaan tingkat spesies memerlukan konfirmasi biokimia yang dijelaskan di bawah.
Cawan 3: Salmonella pada agar EMB dan nonfermenter lain, koloni tak berwarna
Salmonella pada agar EMB dan nonfermenter laktosa terkait, termasuk Shigella dan banyak isolat Pseudomonas, biasanya tumbuh sebagai koloni tak berwarna hingga transparan atau kuning pucat. Beberapa formulasi dan kondisi memberikan rona merah muda samar, sehingga koloni merah muda pucat tidak otomatis merupakan fermenter. EMB tidak membedakan Salmonella dari Shigella atau nonfermenter lain; perbedaan tersebut memerlukan pengujian berikutnya. Perhatikan juga bahwa strain Salmonella positif laktosa dengan koloni metalik seperti E. coli telah didokumentasikan, yang menjadi alasan lain bahwa satu cawan tidak dapat menutup kesimpulan.
Cawan 4: Serratia marcescens dan jebakan formulasi
Serratia marcescens memiliki bagian tersendiri karena mahasiswa sering mengharapkan koloni merah lalu salah membaca cawan. Sebagian besar isolat klinis tidak memfermentasi laktosa, sehingga pada Levine EMB biasanya tampak pucat hingga berwarna lemah. Karena banyak isolat memfermentasi sukrosa, formulasi yang mengandung sukrosa dapat menghasilkan reaksi lebih gelap atau lebih terkait asam. Jangan mengharapkan pigmen prodigiosin merah klasik pada 35 hingga 37 C; produksi pigmen tidak dapat diandalkan pada suhu inkubator. Ketika protokol menyebut Serratia marcescens pada agar EMB, periksa formulasi yang diasumsikan oleh pernyataan tersebut. Tinjauan metabolisme Serratia merangkum pola negatif laktosa dan variasi sukrosa yang menyebabkan jebakan ini.
Cawan 5: kontrol dan organisme yang terhambat
Organisme Gram positif seperti Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, dan Bacillus umumnya terhambat atau ditekan secara signifikan pada agar EMB, meskipun inhibisi tidak mutlak untuk setiap strain. Panel kontrol membuat pembacaan lebih dapat dipertanggungjawabkan: kontrol E. coli harus menunjukkan pertumbuhan baik dengan warna biru hitam dan kilau, kontrol nonfermenter harus menunjukkan pertumbuhan tak berwarna, dan kontrol inhibisi harus menunjukkan sedikit atau tidak ada pertumbuhan. Jika kontrol inhibisi tumbuh dengan baik, langkah selektif gagal dan semua pembacaan lain pada batch tersebut patut dicurigai. Metode pewarnaan menjawab pertanyaan berbeda dari media kultur; untuk sisi pewarnaan slide dalam laboratorium, lihat atlas pewarnaan methylene blue.
Perbandingan terbatas
| Pengamatan pada agar EMB | Arti kemungkinan | Hal yang tidak ditetapkan |
|---|---|---|
| Koloni biru hitam gelap dengan kilau hijau pada cahaya miring | Fermentasi kuat, E. coli kandidat utama | Identitas spesies; fermenter kuat lain dapat menghasilkan kilau |
| Koloni besar merah muda ungu berlendir, tanpa kilau | Fermenter dengan karakter kapsul, Klebsiella kandidat | Klebsiella pneumoniae secara khusus; Enterobacter tampak serupa |
| Koloni tak berwarna atau transparan | Nonfermenter laktosa, misalnya Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Jenis nonfermenter; Salmonella versus Shigella memerlukan tes lain |
| Koloni pucat ketika warna merah diharapkan | Kemungkinan Serratia pada EMB hanya laktosa pada 37 C | Tidak adanya Serratia; periksa formulasi dan suhu |
| Tidak ada pertumbuhan atau koloni kecil yang tertekan | Kemungkinan inhibisi Gram positif | Sterilitas atau identitas; beberapa strain lolos dari inhibisi |
Tiga kalimat merangkum tampilan yang menyesatkan. Gelap tidak sama dengan E. coli, karena Klebsiella, Enterobacter, dan fermenter lain dapat membentuk pusat gelap tanpa kilau. Merah muda tidak sama dengan Klebsiella, karena fermenter sedang atau lambat dan beberapa nonfermenter yang disebut demikian dapat tampak merah muda atau ungu muda. Kilau tidak sama dengan E. coli definitif, karena fermenter kuat lain dapat menghasilkan kilau. Protokol pengajaran dan gambar kultur campurannya menunjukkan setiap kegagalan ini.
Batas konfirmasi
Agar EMB melaporkan fenotipe, bukan spesies. Organisme berbeda dapat memiliki satu tampilan koloni yang sama, dan satu organisme dapat menyimpang dari gambaran buku teks karena strain, usia, kepadatan, formulasi, dan inkubasi. Karena itu alur pengajaran dan klinis memperlakukan morfologi EMB sebagai dugaan awal.
Alur kerja mahasiswa yang dapat dipertanggungjawabkan adalah: deskripsikan koloni terisolasi (ukuran, warna, pusat, kilau pada cahaya miring, karakter berlendir), catat formulasi, waktu dan suhu inkubasi, serta kontrol; kemudian subkultur koloni yang terisolasi dengan baik hingga murni sebelum tes konfirmasi apa pun. Tindak lanjut umum mencakup pewarnaan Gram ditambah reaksi IMViC untuk identifikasi dugaan E. coli dan koliform, TSI atau KIA serta panel biokimia spesifik organisme untuk organisme enterik, dengan identifikasi serologis, MALDI TOF, atau metode tervalidasi lain ketika tugas membutuhkannya. Untuk latar belakang bagaimana EMB berada di antara media enterik selektif dan diferensial, lihat pengantar media kultur enterik dan tindak lanjut pewarnaan Gram. Untuk pertanyaan terkait tentang apa yang dapat dan tidak dapat dibuktikan oleh pewarnaan slide biru, atlas pewarnaan methylene blue memisahkan pengamatan dan kesimpulan dengan prinsip yang sama.
Tulis pengamatan sebelum kesimpulan. "Koloni biru hitam gelap dengan kilau hijau yang bergantung pada sudut pada Levine EMB selama 24 jam, konsisten dengan fermentasi laktosa kuat" dapat dipertanggungjawabkan. "E. coli, dikonfirmasi" memerlukan langkah konfirmasi yang tidak dapat diberikan oleh cawan saja.